Biosynthese und Funktionen von KDNylierten Glykoproteinen

Alle lebenden Zellen sind mit Glykanen ausgestattet, die an einer Vielzahl wesentlicher Zellfunktionen beteiligt sind. Säugetiere tragen auf Glykanen von Glykoproteinen und Glykolipiden am Ende üblicherweise die Sialinsäure Neu5Ac, ein negativ geladener Zucker mit neun Kohlenstoffatomen. Im Gegensatz zu Neu5Ac sind die biologischen Funktionen und immunogenen Profile einer desaminierten Sialinsäurevariante namens KDN unbekannt. Die einzigartigen Eigenschaften von KDN sind (i) Resistenz gegen Sialidase-Aktivität, (ii) Beendigung der Polysialinsäure-Kettenlänge, (iii) potenzieller natürlicher Lockvogel gegen Mikroorganismen, die Glykokonjugate mit Neu5Ac nutzen, und (iv) Antigenmarker bei verschiedenen Krebsarten. Die einzigartigen Merkmale von KDN und der Mangel an Wissen über die biologischen Funktionen tragen zur Bedeutung der vorgeschlagenen Forschung bei. Die übergeordneten Ziele des Antrags bestehen darin, KDNylierte Glykanstrukturen zu erzeugen und die strukturellen und funktionellen Auswirkungen auf ausgewählte menschliche Glykoproteine aufzuklären. Wir gehen davon aus, dass die koordinierte Expression von fünf nicht-pflanzlichen Enzymen verschiedener Arten zur Bildung rekombinanter Glykoproteine mit KDNylierten N-Glykanen führt, die möglicherweise neuartige biologische Funktionen haben. Um die biologische Funktion KDN-haltiger Glykoproteine zu erforschen, muss der KDN-Biosyntheseweg in einem geeigneten Wirtssystem konstruiert werden. Die transiente Expression in Pflanzen ist ein etablierter Ansatz für Glycoengineering und rekombinante Proteinproduktion und Pflanzen sind gut geeignet, da ihnen der störende Neu5Ac-Sialinsäure-Biosyntheseweg fehlt. Der Biosyntheseweg von KDN wird durch eine transiente Expressionsmethode über Agroinfiltration eingeführt. Um die Expression und Aktivität zu optimieren, wird eine Reihe von Expressionskonstrukten generiert, die unterschiedliche Kombinationen von Promotor-Terminator- und subzellulären Lokalisierungssignalen tragen, und zur Produktion von freiem KDN, CMP-KDN und KDN-haltigen N-Glykanen verwendet. Die resultierenden Produkte werden mittels HPLC und Massenspektrometrie analysiert. In-vitro-Bindungstests werden durchgeführt, um die Rolle von KDN auf IgG1-N-Glykanen bei der Fcγ-Rezeptor-Interaktion zu untersuchen, und in-vivo-Experimente werden durchgeführt, um das pharmakokinetische Profil von KDNylierten Glykoproteinen zu untersuchen. In Säugetierzellen überlappen sich die Biosynthesewege von CMP-Neu5Ac und CMP-KDN auf verschiedenen Ebenen. Daher verhindert das Vorhandensein eines nativen Sialinsäurewegs die Bildung homogener KDNylierter Glykoproteine. Pflanzen produzieren komplexe N-Glykane, verfügen jedoch nicht über einen Sialinsäureweg. Die heterologe Expression des KDN-Biosynthesewegs wird es erstmals ermöglichen, KDNylierte Glykoproteine mit hoher Homogenität zu produzieren und deren funktionelle und biochemische Eigenschaften zu untersuchen.