Bioremediation von Per- und Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS) – Entwicklung eines Disparitätsmutatorsystems in Pseudomonas spp. zur Stammverbesserung hinsichtlich gesteigerter Fähigkeiten zum biologischen Abbau von PFAS (PFAS-Biorem)

PFAS sind persistente organische Verbindungen, die aus einer hydrophilen Kopfgruppe und einer hydrophoben Alkylkette variabler Länge (4-16 C-Atome) bestehen, die teilweise (poly-) oder vollständig (per-)fluoriert ist. PFAS werden seit den 1940er Jahren häufig in industriellen und kommerziellen Produkten wie Feuerlöschschäumen, Materialien für Kochgeschirr, Hochtemperaturschmiermitteln, Skiwachs, wasserabweisender Kleidung und vielen weiteren Produkten verwendet. Sie sind mittlerweile weltweit in der Umwelt nachweisbar, verunreinigen Boden und Wasser und können die menschliche Gesundheit schädigen. Obwohl PFAS für ihre hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber biologischem Abbau bekannt sind, gibt es einige Arten, die diese Verbindungen zumindest teilweise abbauen können, z.B. einige Pseudomonas spp. Es wurde gezeigt, dass diese Perfluoroctansulfonat (PFOS) zu einem gewissen Grad abbauen können, und es wurde beobachtet, dass manche Pseudomonas-Stämme eine starke Toleranz gegenüber Fluorid besitzen. In unserem Projekt werden wir eine angepasste Variante der von Luan et al. (2013) beschriebenen Methode zur Bereitstellung von Pseudomonas-Mutanten mit verbesserten PFAS-Abbaufähigkeiten einsetzten. Wir werden Plasmide generieren, die mutierte Varianten des Proteins DnaQ (entsprechend der ε-Untereinheit der DNA-Polymerase III) kodieren; DnaQ ist für die Proofreading-Aktivität des DNA-Polymerase III-Holoenzyms verantwortlich. Je nach DnaQ-Variante erhält man so Plasmide, die starke, mittlere und schwache Mutatoreigenschaften vermitteln. Pseudomonas spp. aus Stammsammlungen oder Stämme isoliert aus PFAS-kontaminierten Umweltproben (Zusammenarbeit mit AIT, Thomas Reichenauer) werden mit diesen Plasmiden transformiert und unter induzierenden Bedingungen kultiviert, wodurch sie beginnen eine der Varianten des mutierten DnaQ-Proteins zu exprimieren, was zu erhöhten Mutationsraten führt. Das Wachstum in Gegenwart von PFAS im Kulturmedium führt zu einer Anpassung durch verbesserte Enzymsätze/Abbauwege/Verwertung von PFAS in spezifischen Klonen, die durch Hochdurchsatz-Screening-Methoden identifiziert und isoliert werden können. Die erfolgten Anpassungen auf Genomebene können durch Gesamtgenomsequenzierung und vergleichende Sequenzanalyse identifiziert werden. Sobald geeignete Klone identifiziert sind, können sie in ein Medium ohne Induktor überführt werden, sodass die Expression des inaktiven DnaQ-Proteins wieder unterdrückt wird oder der erhaltene Stamm wird völlig vom Mutatorplasmid befreit, wodurch die genetische Stabilität wiederhergestellt wird. Nach der Entfernung des Plasmids würden diese Stämme, da keine Fremdgene mehr vorhanden sind, auch nicht als gentechnisch verändert gelten. Die Stämme mit den besten PFAS-Abbaufähigkeiten im Kulturmedium werden dann auf ihre PFAS-reduzierenden Fähigkeiten in verschiedenen Umweltproben wie Wasser oder Boden getestet. Parallel dazu werden spezifische Analysemethoden entwickelt/adaptiert und die beim PFAS-Abbau entstehenden Abbau- und Transformationsprodukte mittels LC-HRMS/MS und LC-Ionenmobilitäts-HRMS/MS analysiert.