Peroxidasin Structure and Interaction Partners

Humanes Peroxidasin 1 (PXDN) ist ein Multidomänenprotein, das eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung hochspezialisierter Basalmembranen spielt. Es katalysiert die Oxidation von Bromid zu hypobromiger Säure, welche wiederum die Bildung einer einzigartigen kovalenten Sulfilimin-Bindung innerhalb des Kollagen-IV-Netzwerks fördert. Diese seltene Vernetzung erhöht nicht nur die mechanische Festigkeit der Basalmembran, sondern unterstützt auch ihre Funktion als Gerüst für Zelladhäsion und -signalisierung. Trotz seiner biologischen Bedeutung sind die strukturelle Organisation und die spezifischen Funktionen mehrerer für Peroxidasin typischer Domänen – wie der leucin-reichen Repeat-Domäne (LRR), der Immunglobulin-Domänen (Ig) sowie des C-terminalen von-Willebrand-Faktor-Typ-C-Moduls (vWFC) – bislang nur unzureichend verstanden. Es wird angenommen, dass diese Domänen an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sind und zur Zelladhäsion beitragen, ihre genauen Funktionen sind jedoch noch nicht geklärt. Ziel 1 dieses Projekts ist es, zu untersuchen, ob Peroxidasin – oder einzelne Konstrukte seiner Domänen – direkt oder indirekt mit anderen Komponenten der Basalmembran interagiert. Die bislang begrenzten strukturellen Daten zu PXDN stellen jedoch ein wesentliches Hindernis für das Verständnis der räumlichen Anordnung seiner Domänen und der Auswirkungen umfangreicher posttranslationaler Modifikationen – wie Glykosylierung und Häm-Einbau – dar. Um die Interaktionen mit extrazellulären Matrixkomponenten zu charakterisieren, werden Bindungsstudien mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) durchgeführt. Zur Schließung dieser Wissenslücke besteht Ziel 2 darin, die dreidimensionale Struktur des voll-längen Peroxidasins in Anwesenheit synthetischer und/oder physiologischer Bindungspartner zu bestimmen. Die Strukturanalyse erfolgt mittels Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie (cryo-EM). Eine zentrale Innovationskomponente des Projekts ist der Einsatz von verkürzten PXDN-Konstrukten für domänenspezifische Bindungsexperimente. Auf diese Weise kann ermittelt werden, welche Domänen für die Interaktion mit bestimmten Basalmembranmolekülen verantwortlich sind. Parallel dazu liefert die Br-Tyrosin-Peptid-Mapping-Analyse mittels Massenspektrometrie ergänzende Informationen zur Bindungsoberfläche. Die Auflösung der Struktur des vollständigen Peroxidasins mittels Kryo-EM wird letztlich neuartige Einblicke in die Dynamik der Domäneninteraktionen und intermolekularen Bindungen ermöglichen. Die Arbeiten erfolgen in enger Zusammenarbeit mit Prof. Kristina Djinović-Carugo vom Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) in Grenoble als internationaler Partner.