Katalase-Peroxidase aus phytophathgenen Pilzen

Katalase-Peroxidasen (KatG) sind bifunktionelle homodimere Häm-Enzyme mit hoher peroxidatischer und katalatischer Aktivität. Neben Eubakterien und Archaebakterien wurden kürzlich auch KatG codierende Gene in Pilzen gefunden. Sequenz- und Expressionsanalysen in unserem Labor beweisen eindeutig das Vorkommen von zwei Gruppen, nämlich (i) intrazellulären und konstitutiv exprimierten Enzymen (KatG1) und (ii) sekretierten und durch oxidativen Stress induzierbaren Enzymen (KatG2). Aufgrund ihrer wahrscheinlichen Rolle bei der Phytopathogenität von Pilzen werden in diesem Projekt KatG Paraloge aus den Pilzen Magnaporthe grisea und Giberella zeae untersucht. Basierend auf der bereits erfolgreichen Klonierung der cDNA von KatG1 und KatG2 aus beiden Organismen und Expression in verschiedenen E. coli Stämmen besteht nun erstmals die Möglichkeit einer umfankreichen biochemischen und biophysikalischen Charakterisierung beider Gruppen eukaryotischer Katalase-Peroxidasen. Mittels Multi-mixing Stopped-flow Analyse und spektroelektrochemischen Untersuchungen sollen die spektralen Eigenschaften der Redoxintermediate sowie die Kinetik und Thermodynamik der Redoxübergänge untersucht werden. Strukturelle Untersuchungen an ausgewählten Vertretern werden sowohl in Lösung (Resonanz Raman Spektroskopie) als auch mittels Röntgenkristallographie durchgeführt. Aufgrund der Tatsache, dass viele mechanistische Details der bifunktionellen Aktivität dieser Enzyme noch völlig ungeklärt sind (z.B. Ort der Bindung und Oxidation von Ein-Elektronendonoren sowie Natur der Peroxidasesubstrate) werden erstmals verschiedene Mutagenesestrategien an diesen Oxidoreduktasen erprobt, nämlich (i) zufallsbasierte Mutagenese kombiniert mit Negativselektion von bis zu 10.000 Klonen um Hinweise auf die für die Peroxidase-Aktivität relevanten Reste zu erhalten. Interessante Klone aus diesen Untersuchungen werden sequenziert und einer Sättigungs-Mutagenese unterzogen. Zusätzlich werden aufgrund erfolgter Strukturanalyse als mögliche Substratbindungsstellen erkannten Regionen dieser Mutagenese-Strategie unterzogen. Zusätzlich wird versucht, durch DNA Fragment Mischung von den interessantesten Klonen und durch Mischen von KatG1 und KatG2 bzw. von prokaryotischen und eukaryotischen KatGs neue hybride Katalase-Peroxidasen mit veränderter enzymatischer Aktivität zu finden und zu charakterisieren. Schließlich postulieren wir, dass die Protease- und Temperatur-unempfindliche, lösliche und Häm-freie C-terminale Domäne - aufgrund hoher Sequenz- und Strukturhomologie mit der funktionellen N-terminalen Domäne - eine ideale Proteinmatrix darstellt, um eine Designer-Peroxidase zu (re)konstruieren. In einem ersten Schritt soll durch stufenweise Mutagenese die Hämbindung und –reaktivität (wieder)hergestellt werden.