Biochemie der Peroxidasine

Enzyme der Peroxidase-Cyclooxygenase Superfamilie katalysieren biochemische Reaktionen, die in unzähligen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen, z.B. bei der unspezifischen Immunabwehr, der Synthese der Schilddrüsenhormone oder der Bildung und Modifizierung der extrazellulären Matrix. Sie sind zudem auch bei der Pathogenese von chronischen entzündlichen Erkrankungen beteiligt. In der Subfamilie 2 dieser Superfamilie findet man Multidomänen-Oxidoreduktasen, sog. Peroxidasine (Pxds). Hierbei handelt es sich um glykosylierte und sekretierte Häm-Peroxidasen, die zusätzlich zur katalytischen Domäne sog. Leucin-reiche Wiederholungssequenzen, Immunoglobulin C-ähnliche Domänen sowie von Willebrandfaktor C enthalten. Diese Strukturmotive finden sich in vielen extrazellulären Molekülen, die mit anderen Proteinen in Wechselwirkung treten. Ursprünglich wurde Peroxidasin in Basalmembranen von Drosophila entdeckt. Spätere Arbeiten zeigten, dass diese Enzyme auch in Wirbeltieren vorkommen und eine Rolle bei der unspezifischen Immunabwehr, der Gewebsbildung, Ausbreitung von Tumoren und oxidativen Prozessen eine Rolle spielen. Kürzlich wurde gezeigt, dass dieses Metallprotein mit Hilfe von Hypohalogeniten im Kollegen IV für die Bildung von kovalenten Kohlenstoff-Stickstoffbindungen verantwortlich ist, ein Prozess, der sowohl bei der Gewebsbildung als auch bei zahlreichen Kranksheitsbildern eine wichtige Rolle spielt. Trotz der physiologischen Bedeutung dieser neuen Proteinfamilie ist das biochemische Wissen sehr bescheiden. In diesem Projekt sollen daher, basierend auf umfangreichen phylogenetischen Voranalysen und der bereits erfolgreich durchgeführten rekombinanten Produktion von humanem Peroxidasin 1 in tierischen Zellkulturen, die Struktur-Funktionsbeziehungen von vier Peroxidasinen unterschiedlicher Entwicklungsstufe und Sequenz analysiert werden: Peroxidasin 1 von Caenorhabditis elegans, Pxd von Drosophila melanogaster als auch die beiden humanen Peroxidasine 1 & 2. Basierend auf der rekombinanten Produktion der vier Modell-Proteine in voller Kettenlänge bzw. von verkürzten Varianten unterschiedlicher Domänenzusammensetzung werden umfangreiche bio-chemische/biophysikalische Analysen durchgeführt: (i) UV-vis-, Fluoreszenz- CD-, Lichtstreuung-, RR- und ESR-Spektroskopie, (ii) Stopped-flow-Spektroskopie und Polarographie, (iii) MS und Röntgenkristallographie, (v) Spektroelektrochemie und (vi) Kalorimetrie. Mit Hilfe dieser Methoden sollen Struktur und Aktivität der Peroxidasine aufgeklärt werden wie z.B. (i) oligomere Struktur und Architektur des aktiven Zentrums, (ii) Interaktion der Domänen und Mechanismen der Proteinentfaltung, (iii) Chemie der prosthetischen Gruppe inklusive Oxidations- und Spinzustände, Häm-Liganden und posttranslationale Modifizierungen, (iv) Spezifität, Zugänglichkeit, und Bindungorte von Substraten als auch chemische Natur der Reaktionsprodukte (v) Chemie, Reaktivität und Relevanz von Redox-Intermediaten und (vi) die Rolle von konservierten Aminosäuren in der Bindung und im Umsatz von Substraten. Klares Ziel dieses Projektes ist die Aufklärung der molekularen Basis der enzymatischen Aktivität von Peroxidasinen und die Präsentation der ersten hoch aufgelösten dreidimensionalen Strukturen dieser neuen Enzymklasse. Durch die vergleichende Analyse von Proteinen aus Invertebraten und Vertebraten werden zudem neue Erkenntnisse zur Evolution dieser Oxidoreduktasen und ihrer biologische Funktion(en) erzielt werden.