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Dominik Brunner (2018): Recombinant expression of B-Cell CD19 fusion proteins in Chinese hamster ovary cells.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 109. UB BOKU obvsg FullText

Datenquelle: ZID Abstracts

Abstract:

Ziel dieser Arbeit war es, Fusionsproteine des extrazellulären Teils von CD19 in Chinese Hamster Ovary Zellen (CHO) rekombinant zu exprimieren. CD19 ist ein Transmembranprotein, das auf B-Lymphozyten vorgefunden wird und ist dadurch ein vielversprechendes Ziel der CAR-T-Zelltherapie für Non-HodgkinLymphome. Für die Expression in CHO-K1-Zellen wurden Klonierungsschritte durchgeführt, um die Plasmid-Expressionsvektoren für die stabile Transfektion unter Verwendung von PEI herzustellen. Die Zellen wurden in einer Batch-Kultur in einem 50 ml-Kultivierungsröhrchen kultiviert, die Selektion wurde über G418/neoR induziert und die Quantifizierung von CD19-Konstrukten wurde mittels ELISA durchgeführt. Zusätzliche durchflusszytometrische Analysen wurden für den intrazellulären Produktgehalt und die Zellpopulationshomogenität durchgeführt. Titer zwischen 50-100 ng/ml für CD19-Fc, 100-200 ng/ml für CD19-HSAD2 und 200-500 ng/ml für CD19/CD21mutFc konnten erzielt werden. Kein CD19 wurde in den final produzierenden Klonen von CD19/CD21mutFc gefunden, was bedeuten könnte, dass der entsprechende Titer nur auf CD21mutFc zurückzuführen ist. Zusätzlich wurden Pseudoperfusionskultivierungen mit CHO-K1/CD19-Fc durchgeführt, wodurch eine Verbesserung in Bezug auf die produzierte Produktmenge im Vergleich zu den Routinekulturen erreicht wurde. Darüber hinaus wurde CD19-Fc erfolgreich über Protein-A-Affinitätschromatographie und IMAC gereinigt. Ein Teil des aufgereinigten CD19-Fc konnte an anti-CD19 CAR-T-Zellen in einem zellbasierten Durchflusszytometrie-Assay binden. Weitere Analysen mittels SDS-Page und Western Blot zeigten, dass eine gewisse proteolytische Aktivität zwischen der Fc-Domäne und dem CD19 auftreten könnte und dass CD19-Fc und CD19-HSAD2 dazu neigen, zu einem gewissen Grad zu aggregieren.

Beurteilende(r): Kunert Renate

1.Mitwirkender: Mayrhofer Patrick

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