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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Masoumeh Ghorbanpour
(2017):
Engineering strategies to improve expression levels of cutinases in P.pastoris and their application on PET hydrolysis.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Umweltbiotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 85.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Das Ziel dieser Arbeit war, das Potential des Enzyms Cutinase als grüne Alternative für die Hydrolyse synthetischer Polymere wie Polyethylene terephtalate (PET) zu beurteilen. Um den Einfluss der Glykolisierung auf die Leistung der cutinase 1 von Thermobifida cellulosilytica (Thc_Cut1), sowie auf die Expressionslevel zu testen, wurden zwei unterschiedliche Dreifachmutanten mit drei Knockoutglykolisierungsstellen erstellt, indem die Nukleotidsequenzen an den Stellen Asn29Asp, Asn49Asp, Asn161Asp (Thc_Cut1_koAsn) and Ser31Ala, Thr51Ala, Ser163Ala (Thc_Cut1_koST) getauscht wurden. Die Enzyme wurden erfolgreich transformiert und im methylotrophen Hefestamm Pichia pastoris KM71H exprimiert. Durch SDS-Page und Glycostainanalyse der an verschiedenen Zeitpunkten während Schüttelkolbenkultivierungen entnommenen Überstandsproben wurde bestätigt, dass die Enzyme Thc_Cut1_koAsn und Thc_Cut1_koST nicht von P.pastoris glykolisiert wurden. Anschließend wurden die Enzyme mit 6xHisTag Affinitätschromatographie aufgereinigt. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der totalen extrazellulären Proteinkonzentration und der volumetrischen Aktivität zwischen der Expression durch das native Enzym Thc_Cut1 und den zwei Knockoutmutanten festgestellt. Die Aktivität der PET Hydrolosierung durch Thc_Cut1 und die Thc_Cut1_ko Mutanten wurde durch Quantifizierung der freigesetzten Produkte wie Terephthalsäure (TPA) and Mono(2-hydroxyethyl) terephthalat (MHET) mittels HPLC gemessen. Es konnte kein klarer Unterschied zwischen den beiden Knockoutmutanten festgestellt werden, jedoch zeigten beide einen Anstieg in der freigesetzten Produktkonzentration im Vergleich zum nativen Enzym Thc_Cut1. Nachdem PETpulver bei einer hohen Pufferstärke (1M), hohen Temperatur (65 °C) und pH 8 für 96 Stunden hydrolisiert wurde, wurden 62 mM lösliche TPA detektiert, was einer Degradierung von 24 % der anfänglichen PET-Konzentration entspricht.
- Beurteilende(r): Gübitz Georg
- 1.Mitwirkender: Gamerith Caroline