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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Hannes Konegger (2017): (Semi)-rational engineering of the protein shell around the cyanid ligand coordinated to the proximal iron atom of the H-cluster in chlorophycaen [FeFe]-hydrogenases.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Abteilung für Biochemie (DCH/BC), BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 98. UB BOKU obvsg FullText

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Die elektrochemischen Eigenschaften von [FeFe]-Hydrogenasen werden maßgeblich durch das komplexe Zwischenspiel des zentralen Eisen-Schwefel Cofaktors und dessen näherer Proteinumgebung beeinflusst. In dieser Arbeit wurde der Ansatz einer gerichteten Evolution verfolgt, um die Effekte einer simultanen Randomisierung zweier Proteinpositionen, welche sich in der direkten Umgebung des CN- Liganden des 2[FeS]-Clusters befinden, zu untersuchen. Zunächst musste dafür ein sensitives, anaerobes und semi-quantitatives Screening Assay, begründet auf der enzymbasierten Reduktion von Methylviologen durch die [FeFe]-Hydrogenase CrHydA1, entwickelt werden. Die Implementierung verschiedenster Methoden der Sättigungsmutagenese in E. coli BL21(DE3)∆iscR zeigte schwerwiegende Probleme bezüglich einer unvorteilhafter Rekombination und Verarbeitung der Bibliothek auf, welche durch eine kleine Modifikation von bereits etablierten Protokollen behoben werden konnten. Das abschließende Screening der Enzym Bibliothek förderte 21 aktive Varianten von CrHydA1 zu Tage, welche anschließend charakterisiert wurden. Dabei konnte die Mutante A94S identifiziert werden, welche im Vergleich zum Wildtyp Enzym überragende katalytische Fähigkeiten aufweist. Die Einführung einer zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Position 94 und dem CN- Liganden trägt dabei vermutlich zu dem gemessenen Anstieg der Oxidations- und Reduktionseffizienz der Variante A94S von jeweils 290% und 130% bei.

Beurteilende(r): Obinger Christian
1.Mitwirkender: Ludwig Roland

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