BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Sarah Theresia Fürst
(2020):
Characterization and modification of a new laccase from Aspergillus flavus for application as antioxidant biosensor.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Umweltbiotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 65.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Oxidativer Stress wird häufig mit sogenannten Zivilisationskrankheiten wie Herz-Kreislauf, oder neurodegenerativen Krankheiten in Verbindung gebracht. Das Ungleichgewicht zwischen reaktivem Sauerstoff Radikalen und Antioxidanten kann zu Zell- und Gewebeschäden führen, daher gehört das Testen des Antioxidantienstatus zur klinischen Routine. Assays, in denen das durch Oxidation mit Peroxidasen und H2O2 hergestellte Radikal ABTS+, welches eine stark grüne Farbe aufweist, durch Antioxidantien reduziert und somit entfärbt wird, sind üblich. Anders als Peroxidasen benötigen Laccasen, keine Cofaktoren wie H2O2 für Oxidationsreaktionen. Die Laccase 1 aus Aspergillus flavus (AfLacc1) und seine Variante AfLacc1:CBD (Cellulose-Bindungs-Domäne) wurden heterolog in Pichia pastoris exprimiert und biochemisch charakterisiert. AfLacc1 weist mit einem pH Wert von 3.4 und einer optimalen Temperatur von 40 °C die für saure Laccasen typischen Reaktionsbedingungen auf. Ebenso konnte ein für die Kupferzentren von Laccasen typisches UV/VIS Spektrum aufgenommen werden. Jedoch stellte sich AfLacc1 als hoch substratspezifisch für ABTS heraus. Durch die Ergänzung mit der CBD, konnte das Enzym spezifisch an Cellulose immobilisiert werden, und die Stabilität sowie die Wiederverwendbarkeit des Enzyms wurde verbessert. Es konnte gezeigt werden, dass das Enzym keine Wechselwirkungen mit wichtigen körpereigenen Antioxidantien aufweist. Ein linearer Zusammenhang zwischen der Menge an oxidiertem ABTS und der daraus resultierenden Absorbtion bei 420 nm besteht, sowie zwischen der Abnahme der Absorbtion bei Zugabe definierter Mengen des Referenzantioxidants Trolox. Außerdem konnten erste Versuche mit humanen Plasma Proben zeigen, dass keine Matrixeffekte negativ auf den Assay einwirken, jedoch die Konzentration an Antioxidantien im Plasma zu hoch ist um sie unverdünnt zu verwenden. Dies stellt auf Grund des erhöhten Arbeitsaufwands einen klaren Nachteil gegenüber bereits verfügbaren Assays dar.
- Beurteilende*r: Gübitz Georg
- 1.Mitwirkender: Ribitsch Doris
- 2.Mitwirkender: Nyanhongo Gibson Stephen