BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Annika Nirschi
(2022):
Production and characterization of procathepsin O glycovariants.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Pflanzenbiotechnologie und Zellbiologie (IPBT),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 78.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Cathepsin O ist eine von 11 Papain-ähnlichen Proteasen aus der Familie der humanen Cystein-Cathepsine. Proteasen dieser Familie spielen eine Schlüsselrolle im lysosomalen proteolytischen System. Wie die meisten Enzyme dieser Klasse wird Cathepsin O als inaktiver Vorläufer synthetisiert, der auch als Proenzym bezeichnet wird. In dieser Studie wurde die Wildtyp-Form von Cathepsin O, sowie eine verkürzte Version davon, mit Punktmutationen versehen, um entweder das Cystein im aktiven Zentrum (C132) in Serin umzuwandeln, die erste oder zweite N-Glykosylierungsstelle (N62 bzw. N105) zu entfernen, oder um eine Kombination dieser Mutationen zu erzielen. Die resultierenden Konstrukte wurden in einen pTT5-Vektor kloniert, in HEK293-6E Zellen transfiziert, und das sekretierte Procathepsin O bis zur Homogenität gereinigt. In einigen Fällen wurde eines der beiden N-Glykane nach der Expression durch das Deglykosylierungsenzym PNGase F entfernt. Ein Ziel der Arbeit war es, Proteinkristalle zu erhalten, welche zur Strukturaufklärung von Procathepsin O herangezogen werden können. Obwohl keine der hergestellten (Glyko-)Varianten kristallisierte, wurden verschiedene biochemische Tests zur weiteren Charakterisierung der Proteine durchgeführt. SDS-PAGE-Gele wurden verwendet, um die hohe Reinheit und die erwartete Größe der Proteine zu bestätigen. DSF-Daten zeigten die höchste Stabilität von Procathepsin O zwischen pH 5,5 und 7,5 und einen starken Abfall der Stabilität unterhalb und oberhalb dieser pH-Werte. Die thermische Stabilität, welche in diesem Fall mittels DSC gemessen wurde, wurde durch die Einbringung der oben erwähnten Mutationen kaum beeinflusst. Alle thermischen Übergangstemperaturen lagen zwischen 59,1 und 60,8 °C, wobei die Stabilität von Procathepsin O durch die Mutation des Cysteins im aktiven Zentrum (C132→S) etwas erhöht werden konnte. Durch die SEC-MALS Analyse konnte bestätigt werden, dass die hergestellten Proteine als Monomere vorliegen und keine Aggregate enthalten. SEC-MALS lieferte darüber hinaus verlässliche Schätzwerte für das native Molekulargewicht jeder Variante.
- Beurteilende*r: Mach Lukas
- 1.Mitwirkender: Kienzl Nikolaus Ferdinand