BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Brigitte Gasser
(2003):
Effects of gene copy number and unfolded protein response on the expression of humaqn trypsinogen in Pichia pastoris.
Diplomarbeit / Masterarbeit,
BOKU-Universität für Bodenkultur.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Auswirkungen der Genkopienzahl und des Unfolded Protein Response auf die Expression von humanem Trypsinogen in Pichia pastoris. Im Zuge unserer Arbeit wurde die Hefe Pichia pastoris als alternatives Expressionssystem für die Herstellung von rekombinantem humanem Trypsin untersucht. Ziel war es, die herkömmlichen Quellen für Trypsin - Rinder- und Schweinepankreas, welche die Möglichkeit von potentiellen pathogenen Verunreinigungen in sich bergen - durch die rekombinante Produktion zu ersetzen und so zukünftige Gefahren zu vermeiden. Obwohl Pichia pastoris als effizientes und sicheres Expressionssystem bekannt ist, wurden während unserer Arbeit gewisse Beschränkungen offensichtlich. Um die Expressionsleistung von rh trypsinogen-exprimierenden P. pastoris Stämmen zu steigern, wurden verschiedene Strategien verfolgt, unter anderem eine Erhöhung der Genkopienzahl. Im Gegensatz zu anderen Studien, führte in unserem Fall die Multikopientransformation nicht zu den gewünschten Ergebnissen. Durch Überschreiten eines oberen Limits von zwei Genkopien wurde die Trypsinsekretion negativ beeinflusst, was darauf hinweist dass verstärkte Sekretion Stress auf die Hefe ausübt. Dieses Optimum von zwei Genkopien konnte nur bei Expression unter Kontrolle des methanol-induzierbaren AOX1 Promoters beobachtet werden, während beim konstitutiven GAP Promoter die Expressionsleistung über die gesamten untersuchten Genkopienzahlen wesentlich geringer war. Intrazellulär angehäuftes Trypsinogen wurde mittels Western Blot Analyse von fraktionierten Zelllysaten in der unlöslichen Proteinfraktion, welche die Membrankompartimente einschließlich des ER enthält, lokalisiert. Stämme, welche den GAP Promoter verwenden zeigten zusätzlich noch zurückgehaltenes Produkt in der cytosolischen Fraktion, doch weitere Untersuchungen dieser Stämme - kultiviert auf einerseits Methanol, andererseits Glukose - ergaben, dass dieser Unterschied in der intrazellulären Verteilung nicht vom Promoter, sondern von den Kulturbedingungen, vorallem der Kohlenstoffquelle, abhängt. Während der Fed Batch Fermentationen zur Produktion von rh Trypsinogen wurde ein starker Anstieg der BiP-Konzentration beobachtet, insbesondere infolge der Induktion der Proteinexpression durch Methanol. BiP ist ein Signalmolekül für ER-Stress ist, welcher auch als Unfolded Protein Response (UPR) bekannt ist. Der UPR Signalübertragungsweg wird durch die Anhäufung falsch gefalteter Polypeptidketten induziert, und bewirkt eine verstärkte Expression von Faltungshelferproteinen und Chaperonen. Potentielle Engpässe des Expressionssystems reichen von der Membrantranslokation über die Signalpeptidabspaltung und die Disulfidbrückenbildung bis hin zur korrekten Proteinfaltung. Durch Überexpression des UPR-spezifischen Transkriptionsfaktors Hac1pi konnte die Trypsinogenexpression um bis zu 50 % gesteigert werden. Dies untermauert die Hypothese, dass die intrazelluläre Zurückhaltung des Trypsinogens aufgrund von Problemen im Zuge der Proteinfaltung basiert.
- Beurteilende(r): Mattanovich Diethard