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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Gerald Posch (2007): Pyranose 2-oxidase: Rational protein design and fermentation engineering for efficient production of the enzyme in E. coli.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Abteilung Lebensmittelbiotechnologie (LBT), BOKU-Universität für Bodenkultur, pp n.a.. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Das Enzym Pyranose 2-Oxidase (P2O) ist aufgrund seiner potentiellen Verwendbarkeit für die Herstellung von wirtschaftlich interessanten Kohlenhydraten gegenwärtig Objekt intensiver Forschungstätigkeit. Sein Reaktionsmechanismus umfasst die Oxidation mehrerer Aldopyranosen an der Position C2, wobei D-Glukose und D-Xylose zu den bevorzugten Substraten zählen. Die Aktivität des Enzyms gegenüber D-Galaktose, dem Ausgangssubstrat für die Synthese des seltenen Zuckers D-Tagatose ist jedoch unzureichend für einen Einsatz in technischem Maßstab. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit versucht, durch den gezielten Einbau einer Punktmutation im aktiven Zentrum die Affinität des Enzyms gegenüber D-Galaktose zu steigern. Position 448 (Glutamin) wurde hiezu mit den 3 unterschiedlichen Aminosäuren Asparagin, Serin und Cystein substituiert. Nach erfolgreicher Mutagenese wurden die jeweiligen Enzymvarianten in E. coli exprimiert und mittels IMAC gereinigt. Wie die Resultate der kinetischen Studien zeigten, ist die gewählte Position jedoch äußerst wichtig für die Bindung des Substrats und dessen Umwandlung, was einen Verlust an Enzymaktivität nach erfolgter Substitution bewirkte. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Optimierung der rekombinanten Produktion von P2O in E. coli unter Verwendung zweier neuer Expressionssysteme, pBAD und pCold. Beide Systeme erwiesen sich als geeignet für die heterologe Expression des Enzyms, wenngleich der Ertrag an aktiver P2O von dem durch L-Arabinose induzierbaren Plasmid pBAD unter den Erwartungen blieb. Hohe Erträge an aktivem Enzym wurden jedoch bei Verwendung von pCold nach Induktion durch Abkühlen des Nährmediums erhalten. Der Einsatz dieses Vektors unter Fed-batch Bedingungen erwies sich als besonders wirkungsvoll zur Steigerung der Enzymausbeute. Nach Beendigung der Nährstoffzufuhr konnte eine Aktivität von 3300 U/L gemessen werden, was einer 10-fachen Steigerung im Vergleich zur konventionellen Batch Kultivierung entspricht.

BetreuerIn: Haltrich Dietmar
2.BetreuerIn: Ludwig Roland
3.BetreuerIn:

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