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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Oliver Mann (2009): Production, purification and characterisation of Lamprospora wrightii and Botrytis aclada laccase.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Abteilung Lebensmittelbiotechnologie (LBT), BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 115. UB BOKU obvsg FullText

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Die zwei pflanzenpathogenen Pilze Lamprospora wrightii und Botrytis aclada wurden hinsichtlich ihrer Laccaseproduktion untersucht und optimiert. Zusätzlich wurde aus B. aclada eine Laccase rekombinant in Pichia pastoris exprimiert und ebenfalls charakterisiert. Ein Tomatensaftmedium mit Fructose, Pepton, Kupfersulfat und Spurenelementen in Verbindung mit einer hohen Sauerstoffsättigung führt zu einer zufriedenstellenden Laccaseproduktion. Die beste Enzymausbeute für L. wrightii wurde in Schüttelkolben, für B. aclada mit Hilfe einer Fermentation erzielt. Die L. wrightii Laccase konnte mit Hilfe eines schwachen Anionenaustauschers, gefolgt von einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) und einem Ultrafiltrationsschritt um das 26-fache auf 150 U/mg aufgereinigt werden. Die Laccase vom B. aclada Wildtyp konnte mit Hilfe eines starken Anionenaustauschers, gefolgt von einer HIC und einem Ultrafiltrationsschritt um das 28-fache auf 120 U/mg aufgereinigt werden. Probleme bei der Reproduzierbarkeit ergaben sich durch die Produktion eines extrazellulären Polysaccharides während der B. aclada Kultivierung, wodurch sich die Viskosität der Kulturlösung stark erhöht hat. Die rekombinante Laccase konnte mit Hilfe einer HIC, gefolgt von einem Ultrafiltrationsschritt um das 4-fache auf 61 U/mg aufgereinigt werden. Die pI Werte beider Enzyme sind mit 4.0 für L. wrightii und 5.2 für B. aclada recht unterschiedlich. Bei beiden Pilzspezies konnten keine Isoenzyme gefunden werden. Alle Laccasen haben ein Molekulargewicht von circa 75 kDa und zeigen typische pH-Optima bei 3.0 für ABTS und 6.0 für Syringaldazin. Die Temperaturoptima mit 35-45°C sind generell sehr niedrig. Die Enzyminaktivierung beginnt bei 45°C, wobei nur die rekombinante Laccase eine bessere Hitzeresistenz bis 60°C aufweist. Die L. wrightii Laccase hat mit 35 kJ/K mol eine doppelt so große Aktivierungsenergie wie beide B. aclada Enzyme. Bezogen auf die Inhibierungs- und Michaelis-Menten Kinetik weisen die B. aclada Laccasen geringere Beeinflussung durch verschiedene Anionen und niedrige Km-Werte für alle getesteten Substrate auf. Hervorzuheben ist das rekombinante Enzym mit einem besonders niedrigen Km-Wert von 5 µM für ABTS und Syringaldazin.

Beurteilende(r): Haltrich Dietmar
1.Mitwirkender: Ludwig Roland

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