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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Julia Anzengruber (2009): Screening for pyranose 2-oxidase variants with enhanced electron acceptor interaction for application in biofuel cells.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Abteilung Lebensmittelbiotechnologie (LBT), BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 67. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Pyranose 2-Oxidase (POx) ist ein tetrameres Flavoenzym, welches in Lignin abbauenden Pilzen vorkommt. Es katalysiert die C-2 Oxidation von Aldopyranosen zu 2-Keto Zuckern. In dieser Reaktion werden Elektronen auf Sauerstoff übertragen und Wasserstoffperoxid entsteht. Die Fähigkeit Elektronen auch auf andere Akzeptoren zu übertragen macht das Enzym interessant für die Anwendung in Biobrennstoffzellen. Um POx Varianten von Trametes multicolor zu finden, welche eine höhere katalytische Aktivität mit Ferrocenium zeigen, wurde eine Mutantenbibliothek heterolog in E. coli exprimiert und in 96-well Platten gescreent. Interessante Varianten wurden in größerem Maßstab kultiviert. Unerwartet zeigten gereinigte POx Varianten keine erhöhte Aktivität mit Ferrocenium, obwohl in den Rohextrakten eine hohe Aktivität gemessen wurde. Nicht identifizierbare Substanzen waren verantwortlich für die Ferrocenium Reduktion und führten zu falschen Annahmen im Screening. Daraufhin wurden in dieser, aber auch in vorherigen Arbeiten hergestellte Varianten mit Ferrocenium als Elektronenakzeptor und D-Glukose als Donor kinetisch charakterisiert. Variante I300V/V546C erreichte mit 185 s-1 einen beinahe doppelt so hohen kcat als wtPOx (kcat = 108). V546C/T169N [(kcat/KM) = 907] und T169N [(kcat/KM) = 669] zeigten aufgrund sehr guter Substrataffinität eine weitaus höhere katalytische Effizienz als wtPOx [(kcat/KM) = 159]. Ein pH Optimum zwischen 7,0 und 8,0 konnte für alle getesteten Varianten bestimmt werden. Elektrochemische Studien, ausgeführt mit einem Fließinjektionssystem, zeigten, dass Biosensoren, bestehend aus der wtPOx zusammen mit dem Osmium Redox Polymer Poly(1-Vinylimidazol)12-[Osmium(4,4´-Dimethyl-2,2´-Bipyridyl)2Cl2]2+/+ absorbiert auf Graphit Elektroden, Imax Werte von 1,41 µA und 1,26 µA mit den Substraten D-Xylose and D-Glukose erreichten. Varianten N593R (Imax = 0,32 µA) and I300V/V546C (Imax = 0,82 µA) zeigten kleinere Imax Werte mit D-Glukose, aber geringere KM Werte als wtPOx.

Beurteilende(r): Haltrich Dietmar
1.Mitwirkender: Ludwig Roland

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