BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Gerhard Stadlmayr
(2011):
High throughput techniques for host cell engineering in Pichia pastoris.
Dissertation - Studienabteilung,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 118.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Mikroorganismen werden heutzutage erfolgreich für die Produktion von technischen und pharmazeutischen Proteinen eingesetzt. Die metylotrophe Hefe Picha pastoris wurde in den letzten Jahrzehnten zu einem der bedeutendsten Expressionssysteme aus der Gruppe der Pilze. Obgleich zahlreiche Fortschritte auf dem Gebiet der rekombinanten Proteinproduktion in Mikroorganismen erreicht wurden, bleibt die Herstellung, insbesondere von komplexen Proteinen, eine schwierige Aufgabe und ist weit von einem Optimum entfernt. Die Produkttiter variieren von wenigen Milligramm bis einige Gramm pro Liter und sind sehr stark von den Eigenschaften des Zielproteins abhängig. Bis ein vollständiges in silico metabolisches Netzwerk der P. pastoris Zelle zur Verfügung steht, werden der rationelle Ansatz und die Anwendung von Hochdurchsatz-Methoden für die Stammverbesserung weiter gemeinsam im Fokus der Forschung stehen. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Hochdurchsatz-Stammverbesserungs-Methode, basierend auf Durchflusszytometrie, für die Identifizierung von Zielprotein-spezifischen Faktoren, die die Sekretion des Zielproteins in P. pastoris verbessern. In Kombination mit der entwickelten „Genome-scale Analysis of Library Sorting“ Methode konnten neue Einblicke in die Limitierungen der Proteinsekretion von P. pastoris gewonnen werden. In einem Fallbeispiel wurden die entwickelten Methoden erfolgreich für die Verbesserung der Sekretion des Fab Fragmentes des monoklonalen Antikörpers 2F5 gegen HIV-1 angewendet. Es konnten drei verschieden Gene identifiziert werden, welche die Produktausbeute um das bis zu 1,8 fache steigern. Eines dieser Gene ist der Transkriptionsfaktor NRG1. Eine genauere Charakterisierung der Überexpression von P. pastoris NRG1 zeigt einen komplexen Zusammenhang zwischen Proteinsekretion und verschiedenen zellbiologischen Parametern auf globaler transkriptioneller Ebene. Zusätzlich wurden in der vorliegenden Arbeit 24 neue Promotoren charakterisiert um das Spektrum der verfügbaren Promotoren für die rekombinante Proteinproduktion in P. pastoris zu erweitern. Die Promotoren wurden in das neu konzipierte modulare Vektorsystem pPUZZLE kloniert und im Bezug auf Produktausbeute untersucht.
- Betreuer: Mattanovich Diethard