BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Astrid Mecklenbraeuker
(2011):
Characterization of novel promoters in Pichia pastoris.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 87.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Pichia pastoris wird häufig als Wirtsorganismus für die Herstellung heterologer Proteine verwendet. Verglichen mit anderen Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, ist die Anzahl verwendbarer Promotorsequenzen relativ klein und auch limitiert auf Promotoren mit sehr starker Aktivität. Für manche Anwendungen, wie Metabolic Engineering, der Co-Expression von Sekretions-Helfern, oder der getrennten Expression von multimeren Proteinen, wie z.B. leichte (LC) und schwere Kette (HC) von Antikörpern, kann es sinnvoll sein verschiedene Promotoren mit unterschiedlichen Transkriptionsstärken zu verwenden. Es ist daher nützlich, eine Auswahl verschiedener Promotorsequenzen zu haben, variierend von starker Promotoraktivität zu schwacher oder reduzierter Promotoraktivität. In der vorliegenden Studie wurden Klone kultiviert, die entweder ein intrazelluläres Reporterprotein (verbessertes grünfluoreszierendes Protein, eGFP) oder ein sekretiertes Fremdprotein (menschliches Serumalbumin, HSA) exprimieren. Promotoraktivitäten wurden indirekt durch Messung der Genproduktmenge bestimmt. Nicht nur die Transkriptionsstärke der ausgewählten Konstrukte, sondern auch die Genkopienzahl wurde mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) bestimmt, da eine Vernachlässigung dieses Faktors zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen kann. Oft führen höhere Genkopienzahlen, unabhängig von der Promotoraktivität, zu höheren Expressionsraten. Besonders PPET9, einen ADP/ATP Carrier der mitochondrialen Membran kodierend, führte zu hohen relativen Expressionsraten des intrazellulären eGFP, stattdessen gab der wachstumsabhängige PTEF1 höhere Ergebnisse mit HSA als Reporter. Fed batch Kultivierung von ausgewählten Konstrukten bestärkte die Korrelation von Promotoraktivität zu spezifischer Wachstumsrate auch für PTHI1. Allgemein resultierte eine höhere Transkriptmenge in größeren Mengen an exprimiertem Reporterprotein, mit PGAP als den Promotor mit der höchsten Transkriptmenge für beide Reporter. Es ist außerdem wichtig das Reporterprotein zu berücksichtigen, da verschiedene Gene unterschiedliche Expressionsraten unter der Kontrolle des gleichen Promotors haben. Abschließend erlaubt dies, die Expression eines gewünschten Proteins, durch die Auswahl geeigneter Promotorsequenzen abhängig von der Situation, zu regeln.
- Beurteilende(r): Mattanovich Diethard
- 1.Mitwirkender: Gasser Brigitte