BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
David Alejandro Peña Navarro
(2020):
Engineering the redox metabolism of Pichia pastoris for improved protein production.
Dissertation - Institut für Mikrobiologie und Mikrobielle Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 138.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Die Produktion von rekombinanten Proteinen ist ein komplexer und metabolisch anspruchsvoller Prozess, die Vorläufer aus dem zentralen Kohlenstoffmetabolismus sowie Redoxäquivalente und Energie-Cofaktoren verbraucht. In der Hefe Pichia pastoris (syn.: Komagataella spp.) wurde zuvor gezeigt, dass ein erhöhter Stoffwechselfluss durch den Pentosephosphatweg die Proteinproduktion verbesserte, was auf einen Zusammenhang mit dem Redoxmetabolismus hindeutet. In dieser Arbeit wurde ein Models des Stoffwechsels verwendet, um NADH- (oder NADPH-) abhängige Dehydrogenasen im zentralen Kohlenstoffmetabolismus zu identifizieren, die beim Ersatz durch NADPH- (oder NADH-) abhängige Varianten die Proteinproduktion in silico erhöhten. Optimale Proteinproduktion erforderte wesentliche Änderungen in der Flussverteilung des zentralen Kohlenstoffmetabolismus. Daher wurde ein Multi-Omics-Ansatz verwendet, um die metabolische Reaktion auf die vorhergesagten Strategien zu messen. Hierbei wurden zielspezifische metabolische Einschränkungen des Redox-Engineerings sowie Mechanismen identifiziert, die den zellulären Redoxzustand ausgleichen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit eines optimalen Redoxgleichgewichts, um rekombinante Proteine effizient zu produzieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion neuartiger fluoreszenzbasierter Redoxsensoren in der Hefe P. pastoris charakterisiert. Anhand in-vivo Assays und in permeabilisierten Zellen wurde gezeigt, dass die Sensoren in P. Pastoris nur teilweise funktionsfähig sind. In den Mitochondrien lokalisierte Redoxsensoren reagierten empfindlicher auf Änderungen von NADH und NADPH als im Cytosol. Der mögliche Einfluss von pH-Wert, Puffer und Proteinfaltung auf die Funktionalität der Sensoren wurde daher diskutiert. Schließlich wurden die Sensoren verwendet, um kompartmentspezifische Änderungen des Redoxzustands von P. pastoris Stämmen zu messen.
- Betreuer: Gasser Brigitte
- 1. Berater: Zanghellini Jürgen
- 2. Berater: Mattanovich Diethard