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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Christina Sophie Hausjell (2019): Inducible reduction of contaminating baculovirus formation in insect cell cultures using artificial miRNAs.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 72. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Das Baculovirus-Insektenzellen Expressionssystem bietet eine vielseitig einsetzbare Plattform zur Herstellung verschiedener rekombinanter Produkte, darunter auch Virus-like Particles, welche aussichtsreiche Impfstoff-Kandidaten sind. Einen Nachteil des Systems stellt allerdings der hohe Aufwand der Downstream Prozessierung, durch die Bildung kontaminierender Baculoviruspartikel während der Produktion, dar. Daher wurde ein induzierbares Knockdown System entwickelt, das amiRNAs mit der Bakteriophagen T7 Expressionsmaschinerie kombiniert. Das Ziel dieser Arbeit war es, zuerst dieses System zu verbessern, indem der read-through T7Ф durch den wirkungsvolleren tZenit Terminator ausgetauscht wurde. Der Austausch resultierte in einer höheren Terminationseffizienz in vitro. Bei der Überprüfung im viralen System, mittels eYFP als Reporter und Durchflusszytometrie, konnte allerdings kein erhöhtes Silencing festgestellt werden. Weiters wurden die Knockdown Fähigkeiten des originalen Systems evaluiert, wenn die baculoviralen Proteine gp64 und vp80, beide erforderlich für das virale Budding, herabreguliert wurden. Das simultane Knockdown von gp64 und vp80 resultierte in einer 1.6-fachen Abnahme der vp80 mRNA ermittelt über RT-qPCR. Da das finale Ziel war, eine viruspartikel-freie Plattform zu entwickeln, wurde weiters untersucht ob die Abnahme auch phänotypisch bemerkbar ist. Bei der Bestimmung mittels qPCR konnte eine 2-fache virale Titer Reduktion festgestellt werden. Möglicherweise auf Grund von Unterschieden der Messprinzipien, sowie deren Sensitivität konnte diese Abnahme bei der Untersuchung durch Plaque Assays nicht bestätigt werden. Die hier erreichte Titer Reduktion ist im Allgemeinen nicht groß genug um eine viruspartikel-freie Produktionsplattform zu generieren. Jedoch könnte die gezeigte Funktionalität der Induzierbarkeit des Systems, in Kombination mit effizienterem Knockdown anderer Methoden, wie beispielsweise CRISPR/Cas9, die Downstream Prozessierung erleichtern.

Beurteilende(r): Grabherr Reingard

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