BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Martin Pfeffer
(2012):
From Fluxes to Protein Titers Strain Engineering in Pichia Pastoris.
Dissertation - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 109.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Die Anwendung rekombinanter Proteine ist für unsere Gesellschaft von außergewöhnlicher Bedeutung, nicht nur für die Wissenschaft, sondern vor allem für unser tägliches Leben. Der stark wachsende Markt für rekombinante Proteine wird insbesondere durch die Erforschung neuer Produkte getrieben. Trotz der Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten können gewisse Proteine noch immer nicht, oder nur in sehr geringen Mengen hergestellt werden und sind somit nicht kommerziell verfügbar. Daher ist die kontinuierliche Verbesserung sogenannter Zellfabriken von großer Wichtigkeit, um bisher nicht rentable Prozesse zu ermöglichen und bestehende Verfahren stetig zu verbessern. Die Hefe Pichia pastoris ist ein beliebter Produktionsstamm für rekombinante Proteine und ist in der Lage, Proteine im Gramm pro Liter Maß in den Kulturüberstand zu sekretieren. Das Antikörperfragment Fab3H6 ist ein anti-Idiotyp zum HIV neutralisierenden Antikörper 2F5 und kann in P. pastoris erzeugt werden, allerdings in vergleichsweise geringen Mengen. Daher war das Ziel dieser Doktorarbeit die Fab3H6 Expression zu steigern. Dies soll mittels Zellengineering Ansätzen erreicht werden. Es wurde bereits gezeigt, dass eine beträchtliche Menge vom Fab3H6 in der Zelle vorhanden ist. Um jedoch die intrazellulären Fab3H6 Fluxe quantifizieren zu können, wurde eine neuartige 34S Markierungstechnik unter produktionsähnlichen Bedingungen in Bioreaktoren etabliert. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass um die 60% des Proteins bereits intrazellulär abgebaut wird. Anschließende Sensitivitätsanalysen der Fluxe zeigten, dass intrazelluläre Proteinbildung vor Proteinsekretion für die Stammverbesserung am Wichtigsten wäre. Zur Steigerung der intrazellulären Proteinbildung wurden neuartige GAP hybrid Promotoren entwickelt. Der „Proof-of-Principle“ für deren gesteigerte Transkriptions- und Translationseigenschaft wurde mittels intrazellulär exprimiertem eGFP gezeigt.
- Betreuer: Mattanovich Diethard
- 1. Berater: Rüker Florian
- 2. Berater: Altmann Friedrich