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Gewählte Dissertation:

Silvia Heiss (2016): DEVELOPMENT OF GENETIC TOOLS FOR HETEROLOGOUS GENE EXPRESSION IN L. PLANTARUM.
Dissertation - Institut für Biotechnologie, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 84. UB BOKU obvsg FullText

Abstract:

Milchsäurebakterien umfassen eine heterogene Gruppe Gram-positiver Bakterien mit geringem G+C Gehalt. L. plantarum CD033 wurde aus einer stabilen Grassilage in Österreich isoliert. Eine hohe Transformationseffizienz (bis zu 109 kbe/µg DNS) macht L. plantarum CD033 attraktiv für Stammverbesserung und genetische Veränderungen. In dieser Thesis haben wir mehrere Shuttle-Vektoren, basierend auf dem L. buchneri CD034 Plasmid pCDLbu1, etabliert. Wir haben endogene konstitutive Promotoren (z.B. Ptuf33 und Ptuf34) getestet. Die optimale Distanzsequenz zwischen Shine-Dalgarno und Translationsstart wurde ermittelt. L. plantarum CD033 enthält ein 7,9 kb großes Plasmid pCD033, welches wir sequenzierten, charakterisierten und annotierten. Die Plasmidkopienzahl und das kleinstmöglich stabile Replikon wurden bestimmt und 8 codierende Sequenzen wurden gefunden. Anhand der erhaltenen Daten vermuten wir einen neuen theta-Replikationsmechanismus für dieses Plasmids. L. plantarum CD033 wurde von pCD033 befreit und der Plasmid freie Stamm L. plantarum 3NSH wurde generiert und für die Expression rekombinanter Proteine evaluiert. Wir haben drei indzuierbare Promotor/Repressor Systeme (PlacA, PxylA and PlacISynth) etabliert und in Bezug auf mCherry Expression getestet. Bevorzugte Induktoren (Laktose, Xylose und IPTG) und deren optimale Konzentrationen wurden mit dem BioLector® micro-fermentation System analysiert. Weiters konnten wir ein induzierbares System für die T7 RNA Polymerase etablieren und erstmals für L. plantarum beschreiben. Die etablierten Konstrukte sind induzierbar (gering verglichen mit einem konstitutiven Promoter) und basale Expression ohne Induktion war vorhanden. Hiermit präsentieren wir einen neuen Plasmid-freien L. plantarum Stamm und Instrumente für dessen biotechnologische Verwendung z.B. für verbesserte Silage oder zur Produktion von rekombinanten Proteinen in einem als sicher eingestuftem GRAS („generally regarded as safe“) Mikroorganismus.

Betreuer: Grabherr Reingard

1. Berater: