BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Patrick Mayrhofer
(2013):
Integration of retargetable FLP/FRT sites into DUKX-B11 CHO cells for Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE).
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 84.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Traditionelle Techniken zur Erstellung rekombinanter Produktionszelllinien aus CHO Zellen basieren auf Transfektionsmethoden welche ein rekombinantes Gen in zufällige genomische Positionen und unvorhersagbarer Kopienzahl integrieren. Eine Technik namens Rekombinase mediierter Kassettenaustausch (RMCE) bietet die Möglichkeit zur gezielten Integration eines beliebigen „gene of interest“ in eine definierte genomische Position durch ortsspezifische Rekombination unter Verwendung des FRT/FLP Systems. Durch diese gezielte Integration des rekombinanten Gens mit einer bestimmten Kopienzahl könnten Zelllinien erstellt werden, die vorhersagbare Expressionsprofile besitzen. In dieser Masterarbeit wurde die Voraussetzung für eine nachfolgende RMCE geschaffen, nämlich die Etablierung der Wirtszelllinie mit einer RMCE-kompetenten Genkassette. Zwei aufeinanderfolgende RMCE Runden wurden in CHO Zellen durchgeführt. Die erstellte Zelllinie trägt eine RMCE-kompetente Kassette, die nachfolgend durch verschiedene rekombinante Genkassetten ausgetauscht werden kann. Die Austauschvektoren wurden durch molekularbiologische Klonierungsexperimente erstellt und modifiziert und mittels verschiedener Transfektionsmethoden in CHO Zellen eingefügt. Der Kassettenaustausch wurde mittels grün fluoreszierenden Proteins als Reportergen nachgewiesen und die erstellten Klone mit UV-Mikroskopie und Durchflusszytometrie analysiert. Mit Hilfe verschiedener positiver Selektionsmarker wurde auf geeignete Klone selektioniert. Die integrierten RMCE-Kassetten wurden mit PCR detektiert. Nach jeder RMCE-Runde konnte der Kassettenaustausch durch PCR Analysen verfolgt werden. Mit dieser Strategie konnten rekombinante Zelllinien entwickelt werden, die RMCE-kompetente genomische Loki besitzen, fluoreszieren und resistent gegenüber der Substanz G418 sind. Diese Loki könnten anschließend durch beliebige rekombinante Genkassetten ersetzt werden.
- Beurteilende(r): Kunert Renate
- 1.Mitwirkender: Mader Alexander