BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Bernhard Prewein
(2012):
Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Based vs. Conventional Plasmid Transfection
A Comparison Study in CHO Cells.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 101.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Der Markt und die Anwendungsgebiete für therapeutische Proteine, wie unter anderem monoklonale Antikörper, sind durch starkes Wachstum geprägt. Deshalb gewinnen stabile Produktionssysteme und hohe Ausbeuten an Bedeutung. CHO Zellen sind für die Expression von rekombinanten Proteinen weit verbreitet und es gibt eine Vielzahl an Techniken, um eine Produktionszelllinie zu generieren. Weit verbreitet ist die konventionelle Plasmidtransfektion, doch um hiermit einen guten Produzenten zu etablieren, benötigt man Genamplifikation und zeitintensive Scree-ning-Runden. Eine alternative Methode ist die Verwendung von BACs als Transfektionsvektoren welche hohe Zellproduktivitäten auch ohne Genamplifikation erzielen können. Dies liegt daran, dass BACs höher transkribierte, so genannte offene Chromatinregionen mitbringen. Für diese Arbeit wurden zwei scFc Antikörper, 3D6scFc und 2F5scFc, in CHO Zellen exprimiert. Hierzu wurden Zelllinien mit konventioneller Plasmidtransfektion generiert und mit BAC-transfizierten Zellen verglichen. Dabei wurde kontinuierlich das Wachstum und die Produktivität eruiert. Zusätzlich wurden qPCR Analysen durchgeführt um die Zelllinien bezüglich Gen-Kopienzahlen und Transkriptmengen beurteilen zu können. Die intrazelluläre Produktkonzentration wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die spezifischen Produktivitäten waren in BAC-Transfektanten drei- bis vierfach höher als in den Plasmidtransfektanten ohne Genamplifikation. Die Gen-Kopienzahlen und intrazellulären Produktkonzentrationen waren zum Teil höher, doch besonders deutlich war ein Anstieg der Transkriptmenge in BAC-Transfektanten festzustellen. Insgesamt hat sich die Transfektion mittels BAC-Vektoren als eine vergleichsmäßig gute Methode zur Generierung von stabilen, hoch produzierenden CHO Zelllinien herausgestellt.
- Beurteilende(r): Kunert Renate
- 1.Mitwirkender: Mader Alexander