BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Verena Kamleithner
(2014):
On-chip ligase mediated multiplex gene detection
A novel approach for microarray probe design.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 100.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer multiplexen DNA-Detektionsmethode mit neuartigen Sondenkonzepten. Die Herausforderung stellte die Durchführung aller enzymatischen Reaktionen direkt am Chip dar. Vier verschiedene Sondenkonzepte wurden nach dem Vorbild der Padlock-Sonden, welche zu einem Ring ligiert werden, wenn sie an die korrekte DNA hybridisieren, designt und in multiplexen Microarray-Tests evaluiert. Die Idee der Looplock Sonden bestand darin, die spezifischen Capture Sonden in einer Ligationsreaktion fest mit der immobilisierten Sonde zu verknüpfen und zu detektieren. Y-Sonden ermöglichen die Rolling Circle Amplification (RCA) aus der Ringstruktur der ligierten Capture Sonden. Die Detektion des immobilisierten RCA Produkts erbrachte spezifische Ergebnisse in einem 12-plexen Test. LN Sonden wurden mit verschiedenen Spacern konzipiert. Synthetische DNA, aber auch 16S PCR Produkte und genomische DNA wurde erfolgreich mit allen Spacern Ligase-vermittelt identifiziert, wobei die LNC3 Sonde die stärksten Signalintensitäten erreichte und verbesserte Detektionsfähigkeiten gegenüber einer konventionellen Microarray Sonde aufwies. Die Methode erbrachte spezifische Signale in einem 10-plexen Test inklusive Unterscheidung von Einzel-Nukleotid Variationen mit einer Nachweisgrenze von 10^7 Genomkopien. Die 3CR Sonde kombiniert die Eigenschaften der LNC3 Sonde mit einer Option für die RCA und war ebenfalls zur spezifischen Detektion geeignet. In dieser Arbeit werden neuartige Sondenkonzepte mit außergewöhnlichem Potential für die multiplexe Detektion beschrieben. Weitere Bemühungen sollten noch in die Signalamplifikation gesteckt werden, da die RCA nicht die erwartete Verbesserung der Signalintensität erbrachte. Dies wäre jedoch eine elegante Lösung, um jegliche zeitaufwändige Vervielfältigung der Proben-DNA zu vermeiden. Ohne die RCA verfügt die Methode über starke multiplexing Eigenschaften und über eine beachtlich kurze Testzeit von weniger als zwei Stunden.
- Beurteilende(r): Rüker Florian