BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Lukas Brückl
(2013):
Engineering of Elution Conditions of a Protein A Affinity Resin.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 65.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Protein A Affinitäts Chromatographie stellt den am häufigsten angewandten “Capture“ Schritt für die Isolierung von monoklonalem Immunglobin G dar. Die hohe und selektive Affinität zwischen Protein A und dem Fc-Teil des Antikörpers ermöglicht eine gute Abreinigung von Kontaminierungen durch den Produktionsorganismus. Der Nachteil dieser hohen Affinität ist jedoch die Notwendigkeit von tiefen pH-Werten beim Desorbieren der Säule, was zur Aggregation des Produktes führen kann. Die industriell am häufigsten verwendeten Elutionspuffer sind hierbei Glycin/HCl, Citrat und Acetat. Der erste Teil dieser Arbeit umfasste die Charakterisierung des Harzes AmsphereTM JWT203. Optimale Pufferzusammensetzungen wurden ermittelt, um einerseits das Retentionsvolumen gering zu halten und andererseits den pH Wert zu kontrollieren. Eine semi-empirische Funktion konnte gefunden werden, um den Einfluss der Molarität und des pH-Wertes des Buffers auf den pH-Wert im gesammelten Produkt zu beschreiben. Weiters wurde die Stabilität des Liganden getestet, indem das Harz jeweils 30 Minuten mit 0.5 M NaOH inkubiert wurde. Das Ergebnis zeigte eine Abnahme der dynamischen Bindingskapazität um ca. 45 % über 100 Zyklen. Ermittelte Daten zum Bluten des Liganden, so genanntes „ligand leaching“, zeigten, dass die Menge stark nach dem ersten Lauf abnimmt. Auf dieser Erkenntnis aufbauend konnte eine Waschprozedur entwickelt werden, um das Bluten des Liganden während des ersten Aufreinigungszyklus zu reduzieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Modell zur Vorhersage des pH-Verlaufs während des Elutionsschrittes von Protein A Affinitäts Harzen mit ungeladenem Grundgerüst (wie z.B.: MabSelect XtraTM) entwickelt. Das Modell stützt sich dabei auf eine Titration des an das Harz gebundenen IgGs, welche den rapiden Abfall des pH-Wertes zu jenem des Elutionspuffers verhindert. Ein weiteres pH-Modell, entwickelt von Carta und Hahn, kann nun auf Basis des Titrationsmodelles angepasst werden, um verschiedene IgG-Beladungen des Harzes zu berücksichtigen.
- Beurteilende(r): Hahn Rainer