BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Markus Buchetics
(2017):
Genome-scale analysis of Pichia pastoris during recombinant protein production and methanol utilization.
Dissertation - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 141.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris findet Anwendung als Wirtsorganismus für rekombinante Proteinproduktion. Obwohl bereits relativ hohe Produkttiter für diverse Proteine erreicht wurden, scheint eine weitere Effizienzsteigerung durch intrazelluläre Limitierungen im Sekretionsweg oder im Energiestoffwechsel behindert zu werden. Kulturen, die auf Methanol/Glycerin wuchsen, wurden verglichen mit solchen, die Glukose als einzige Kohlenstoffquelle nutzten, und analysiert auf Transkript-, Protein- und Metabolitenebene. Dadurch zeigte sich, dass in P. pastoris die Methanol-Aufnahme und Verwertung (bis zum Glyzerinaldehyd-3-Phosphat) zur Gänze in den Peroxisomen stattfindet. Eine aktivere Translationsmaschinerie sowie höherer Aminosäurenstoffwechsel wurden ebenfalls entdeckt. In Produktionsstämmen wurden weniger Auswirkungen auf Transkriptom und Proteom festgestellt. Bei der Produktion von Antikörper Fab Fragmenten, die mit dem Sekretionssignal des glykosylierten alpha-Paarungsfaktors (aus S. cerevisiae) versehen sind, wurde ein Hochregulieren von Faktoren zur Glykosylierung festgestellt. Ein neuer Transkriptionsfaktor, Aft1, zur (bis zu 2,5-fach) verbesserten Sekretion einer rekombinanten Carboxylesterase konnte erstmalig beschrieben werden. Dazu wurde das P. pastoris Genom auf mögliche gemeinsame Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen untersucht. Die Suche konzentrierte sich dabei auf Promotorregionen von Genen, die zuvor in anderen Studien als erfolgreiche Sekretionshelfer durch begleitende Überexprimierung beschrieben worden waren. Anders als das Homolog in S. cerevisiae konnte Aft1 nicht der Regulierung des Eisenhaushalts zugeordnet werden. Eine Rolle in der zellulären Antwort auf die Verfügbarkeit einer Kohlenstoffquelle scheint wahrscheinlicher. Für zukünftige Arbeiten zum Zweck von Sekretionsstudien wurden außerdem Kultivierungsprotokolle basierend auf physiologischen und technischen Erkenntnissen für den Kleinstmaßstab entwickelt.
- Betreuer: Mattanovich Diethard
- 1. Berater: Gasser Brigitte
- 2. Berater: Hann Stephan