BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Elisabeth Gludovacz
(2018):
Recombinant production and characterization of human diamine oxidase.
Dissertation - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 108.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Humane Diaminoxidase (hDAO) ist wichtig für die extrazelluläre Degradation von Polyaminen und insbesondere Histamin. Histamin trägt zur Entstehung von Symptomen in verschiedenen schweren, sogar lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Urticaria, Anaphylaxie, und Mastozytose bei. Das Ziel dieser Dissertation war es vorhandene Wissenslücken in Bezug auf hDAO zu schließen und ihren potentiellen Gebrauch als neues Therapeutikum für Histamin-mediierte Symptome zu erforschen. Zu diesem Zwecke wurde eine stabile Chinesische Hamster Ovarien (CHO) Zelllinie für die Produktion rekombinanter hDAO generiert, ein Protokoll zur Aufreinigung etabliert und das gereinigte Enzym umfassend charakterisiert. Der Gehalt an Kupfer und Topaquinon Cofaktor im aktiven Zentrum, sowie kinetische Parameter wurden ermittelt. Die Integrität in Struktur und Aminosäuresequenz wurde verifiziert. Die N-Glykosilierungsstellen Asn168, Asn538 und Asn745 wiesen Säugetier-typische Glykane komplexen Typs auf. An Stelle Asn110 wurden nur Säugetier-untypische oligomannosidische Glykane detektiert. Dasselbe wurde für Asn110 von DAO nativen Ursprungs und von rhDAO aus humanen embryonischen Nierenzelllinien (HEK293), sowie für Asn137 vom mit DAO verwandten humanen vaskulären Adhäsionsprotein-1 beobachtet. Analysen der röntgenkristallographischen Strukturen haben gezeigt, dass sowohl Asn110, als auch Asn137 in einer hoch konservierten hydrophoben Spalte liegen, die mit den angehängten Glykanen interagiert und damit wahrscheinlich die lokale Proteinfaltung stabilisiert. Das Ersetzen von Asn110 durch Gln110 führt zu einer kompletten Inhibierung der Sekretion und zur Retention von rhDAO im Endoplasmatischen Retikulum. Mutationen von Asn168, Asn538 und Asn745 hatten jeweils minimale, starke und moderate Effekte, ohne relevante Auswirkungen auf die spezifische DAO-Aktivität. Diese Ergebnisse stimmen mit der evolutionären Konservierung der vier N-Glykosilierungsstellen überein.
- Betreuer: Borth Nicole