BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Linda Schwaigerlehner
(2015):
Antibody gene expression in CHO cells with recombinase mediated cassette exchange.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 105.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Bei traditionellen Transfektionen wird das Transgen zufällig in die Chromosomen der Wirtszelllinie integriert. Das Expressionsniveau der transfizierten Zellen ist üblicherweise variabel und nicht stabil. Dies wird zum Teil durch den unvorhersehbaren Einfluss von zufälligen Intregrationsseiten verursacht, auch bekannt als Positionierungseffekt. Um diese bedeutenden Probleme zu beheben, wird eine Möglichkeit zur gezielten Genintegration dringend benötigt, um Antikörper-produzierende Zelllinien unter isogenen Bedingungen vergleichen zu können. Das Rekombinase mediierte Kassetten Austausch (RMCE) System mit Flippase (Flp) ermöglicht den gezielten Austausch einer Kassette, welche durch zwei heterospezifische Flippase Erkennungsziele (FRT) Seiten flankiert wird. Der Austausch wird durch die Co-Transfektion von Flp Rekombinase zusammen mit der Spender-Kassette durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurden unter der Verwendung des RMCE Systems drei verschiedene IgG1 Antikörper (2G12, Ustekinumab, 4B3) und ihre zugeordneten Keimbahn-Varianten (353/11, 554/12, 136/63) in der Wirtszelllinie CHO RMCE I3 exprimiert. Nach den Co-Transfektionen wurden die Klone durch Grenzverdünnungsklonierung isoliert und durch Enzym-Immunoassay (ELISA) überprüft. Die Subklone wurden in der Routinekultur und Batch Experimenten verglichen. Zusätzlich wurde das intrazelluläre Produkt und GFP mittels Durchflusszytometrie gemessen. Ein weiterer Schwerpunkt wurde auf die Isolierung der genomischen DNA und die Untersuchung der Integrierung des Spender-Plasmids mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) gelegt. Im Allgemeinen wurden die höchsten Produktkonzentrationen bei den Antikörpern 2G12 und 353/11 festgestellt. Die genetische Untersuchung der 2G12 und 353/11 Klone zeigte zum ersten Mal, dass der gezielte RMCE Austausch des GTN Fusionsproteins durch ein Antikörper Spender-Kassette erfolgreich war. Es wurde bewiesen, dass die gezielte RMCE Integration in den neuen CHO K1 Wirt CHO RMCE I3 möglich ist.
- Beurteilende(r): Kunert Renate
- 1.Mitwirkender: Mayrhofer Patrick