BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Mathias Fink
(2016):
Clarification of E. coli homogenates by precipitation.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 52.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Diese Diplomarbeit befasst sich mit der Aufreinigung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) aus dem E. coli Stamm HMS 174(DE3), der das pET11a-GFPmut3.1 Plasmid in seinem Genom trägt. Um das intrazellulär produzierte GFP aus den Zellen freizusetzen wurde Hochdruck Homogenisation verwendet. Im Laufe der Produktreinigung kam es wiederholt zum Auftreten eines Niederschlages, der auch noch nach Zentrifugation und Filtration auftrat. Dieser Niederschlag verursachte schlechte Filtrationsergebnisse und barg die Gefahr Chromatographie Säulen zu beschädigen. Außerdem wurde vermutet, dass der Verdrängungseffekt während der Ionentausch Chromatographie von den Substanzen, die den Niederschlag bildeten, verursacht würde. Es wurde also im Rahmen dieser Arbeit versucht, herauszufinden, worum es sich bei diesen Niederschlag handelte, unter welchen Bedingungen er entstand und ob er gezielt gefällt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass der Niederschlag zu großem Anteil aus Proteinen besteht und seine Bildung hauptsächlich durch Temperatur beeinflusst wird. Um den Niederschlag gezielt zu fällen wurde Hitze, CaCl2 und Polyethylen Glykol (PEG) verwendet. CaCl2 und PEG führten allerdings zu hohen Produktverlusten und wurden daher als nicht geeignet befunden. Im Falle der Hitzefällung wurden im Hinblick auf Kläreffizienz, Reinigungseffekt und Produktausbeute die besten Ergebnissebei ungeklärtem Homogenat erreicht, welches für 3 Stunden bei 50 °C inkubiert und anschließend zentrifugiert wurde. Um das Adsorptionsverhalten zu untersuchen, wurden die Anionentauscher CaptoQ und Q-Sepharose FF verwendet. Der Verdrängungseffekt wurde durch die Hitzeinkubation zwar nicht beseitigt, jedoch konnte er in höhere Konzentrationsbereiche verschoben werden. Weiters wurde untersucht wie die DNA durch die Homogenisations Bedingungen beeinflusst wird. Hierbei konnte gezeigt werden, dass mit steigender Anzahl von Stufen und Passagen, die DNA in kleinere Bruchstücke geteilt wird.
- Beurteilende(r): Hahn Rainer
- 1.Mitwirkender: Luchner Markus