BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Andreas Egert
(2017):
Weiterentwicklung und Optimierung der Proteinaufreinigung mittels Mikropartikel-Technologie.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 78.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Eine Alternative zum mechanischen Zellaufschluss mittels Hochdruckhomogenisator stellen chemische Aufschluss-Methoden dar. Diese erhöhen die Permeabilität von Biomembranen und erlauben somit die Freisetzung intrazellular akkumulieter Produkte (z.B therapeutische Proteine). Mit einer derartigen Methoden, der sogenannten "Mikropartikel Technologie", wurden in den letzten Jahren vielversprechende Ergebnisse bezüglich der Extraktion von zytoplasmatischen Proteinen erzielt. Vor allem die Universität für Bodenkultur hat sich eingehend mit dieser Technologie befasst. Verglichen zu den Ergebnissen eines Zellaufschlusses (Hochdruckhomogenisator) konnte der Grad an Verunreinigungen (Host-Proteine, Nukleinsäuren und Endotoxine), bei gleichbleibenden Produktausbeuten, deutlich vermindert werden. Die extrahierten rekombinanten Proteine wurden an den Mikropartikel adsorbiert und mussten somit nachfolgend wieder desorbiert werden. Während dieser Elutionsschritte wurden die davor gebildeten Flocken jedoch (teilweise) zerstört und konnte somit nicht mittels Filtration abgetrennt werden, da die Filter innerhalb weniger Sekunden verstopft waren. In der vorliegenden Arbeit konnten diese Separationsschwierigkeiten für die Extraktionsanwendung überwunden werden. Es wurde eine Methode weiterentwickelt und optimiert, welche es ermöglicht GFP (mittels kationischer Mikropartikeln) aus E.coli Zellen zu extrahieren, dabei jedoch nur einen minimalen Anteil des GFPs an den Mikropartikeln zu adsorbieren. Filtrationen derartiger Extrakte konnten im Labormaßstab ohne Probleme durchgeführt werden. Verglichen mit den Ergebnissen eines Zellaufschlusses mittels Hochdruckhomogenisator wurde eine Produktausbeute von über 85% erreicht, wobei die Verunreinigungen stark reduziert waren. Somit konnte im Extrakt eine GFP Reinheit - bezüglich Fremdproteine - von über 65% quantifiziert werden. Die entsprechenden Extraktionen konnten innerhalb von ca. 6,5h abgeschlossen werden.
- Beurteilende(r): Hahn Rainer