BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Patrick Eßletzbichler
(2017):
Characterization and Engineering of the RNA-targeting CRISPR enzyme Cas13a for nucleotide detection and mammalian applications.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 120.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Die Familie der Cas13a Proteine ist Teil der Klasse 2 Typ VI CRISPR-Cas Systeme und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. Mittels eines Screens in E. coli wurde das neue Ortholog LwaCas13a entdeckt, welches eine viel höhere Aktivität als das zuvor bekannte LshCas13a (auch bekannt als C2c2) hat. Das Protein von LwaCas13a wurde aufgereinigt und für eine in vitro Charakterisierung verwendet, wodurch die Anforderungen an die Spacer und DR Länge beschrieben werden konnten die für eine erfolgreiche Programmierung von LwaCas13a notwendig sind um spezifische Sequenzen anzuvisieren. Es wurde weiters erfolgreich an verschiedenen Zielsequenzen getestet, zeigte nur eine schwache Präferenz für eine H PFS in vitro and verarbeitete erfolgreich seine eigenen pre-crRNA. Eine besondere Aktivität von LwaCas13a, bekannt als Kollateraleffekt wurde entdeckt und zusammen mit einem gequenchten Fluoreszenzreporter als Grundlage für die Entwicklung eines RNA-Detektionsassays verwendet. Gekoppelt mit einem isothermalen Amplifikationsschritt wurde eine Nukleinsäuredetektionsplattform namens SHERLOCK entwickelt. Die Plattform konnte erfolgreich pathogene Sequenzen mit einem einzigen Basenunterschied unterscheiden, wie zum Beispiel jene der Amerikanischen oder Afrikanischen Zika Stämme, für die Genotypisierung menschlicher Speichelproben verwendet werden und für die Detektion von cfDNA angewendet werden. Weiters wurde gezeigt, dass SHERLOCK gefriergetrocknet und innerhalb von 35 Minuten ausgelesen werden kann, wodurch es sich für POC Diagnostika eignet. LwaCas13a wurde dann für die Verwendung in Säugetierzellen technisch optimiert und wir zeigten knockdown der RNA Konzentrationen eines Luziferasereporters. Zuletzt wurde gezeigt, dass die kleinen Proteine die sehr oft mit Cas13b (ein weiteres Klasse 2 Typ VI CRISPR-Cas System) koexprimiert werden dessen Aktivität beeinflussen und zwischen verschiedenen Orthologen ausgetauscht werden können.
- Beurteilende(r): Rüker Florian