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Gewählte Dissertation:

Corinna Rebnegger (2016): The effect of the specific growth rate and the mitotic cell cycle on recombinant protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.
Dissertation - Institut für Biotechnologie, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 101. UB BOKU obvsg

Abstract:

In Pichia pastoris ist die Protein-Sekretion an zelluläres Wachstum gebunden, wobei eine positive Korrelation zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Sekretionsrate beobachtet werden kann. Zudem hat sich das Sekretionsvermögen sprossender Hefen als zellzyklusabhängig erwiesen. Da in Hefen zelluläres Wachstum eng mit dem mitotischen Zellzyklus verknüpft ist, stellt sich folglich die Frage, ob höhere Sekretionsraten bei schnellerem Wachstum auf einer veränderten Zellzyklusphasenverteilung basieren, oder eher auf wachstumsassoziierte Effekte zurückzuführen sind. Das Ziel dieser Studie war es infolgedessen, den Einfluss der Wachstumsrate sowie der Zellzyklusphase auf die rekombinante Protein-Sekretion zu untersuchen. Im ersten Teil der Studie wurden rekombinante P. pastoris Zellen über einen weiten Bereich von spezifischen Wachstumsraten kultiviert und das genomweite Transkriptionsmuster analysiert. Dabei hat sich gezeigt, dass sich Variationen in der Wachstumsrate deutlich auf die Regulation von verschiedensten zellulären Prozessen auswirken und dass einige dieser Prozesse bei schnellerem Wachstum in einer für die rekombinante Protein-Sekretion begünstigenden Art und Weise reguliert sind. Um die Physiologie von P. pastoris bei extrem langsamem Wachstum zu untersuchen, wurde die sogenannte Retentostat-Kultivierung für diese Hefe implementiert. P. pastoris hat sich als äußerst robust gegenüber extremer kalorischer Restriktion erwiesen und reduzierte zudem seine Erhaltungsenergie. Um schließlich zwischen auf dem Zellzyklus basierender und wachstumsratenassoziierter transkriptioneller Regulation unterscheiden zu können, wurde eine Methode zur Sortierung von fixierten Zellen nach dem DNA-Gehalt und anschließender Isolation von RNA entwickelt. Diese Methode wurde auf rekombinante P. pastoris Zellen angewandt, welche bei einer langsamen und einer schnellen Wachstumsrate kultiviert wurden. Es hat sich gezeigt, dass tatsächlich einige Prozesse, welche als vorteilhaft für die Proteinproduktion gewertet werden, abhängig von der Zellzyklusphase reguliert werden. Insgesamt erscheint jedoch der Einfluss der Wachstumsrate auf diese Prozesse ausgeprägter zu sein.

Betreuer: Mattanovich Diethard

1. Berater: Mach Lukas

2. Berater: