BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Florian Weiss
(2016):
Production of GFP from inclusion bodies.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 56.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- In E. coli rekombinant hergestellte Proteine führen oft zur Bildung von inclusion bodies. IBs sind inaktive aggregierte Proteine und müssen daher rückgefaltet werden um ein biologisch aktives Protein zu erhalten. Im Zuge dieser Arbeit wurde die Herstellung von green fluorescent protein (GFP) aus IBs untersucht, wobei der Fokus auf drei Schwerpunkten lag: (i) die Reinigung von GFP-IBs mittels Zentrifugation; (ii) der Einfluss der Renaturierungsstrategie auf die Ausbeute und die Bildung von löslichen Proteinaggregaten; und (iii) die Reinigung des rückgefalteten, nativen GFP mittels Anionenaustauschchromatographie. Es konnte gezeigt werden, dass differentieller Zentrifugation eine leistungsstarke und einfache Methode ist, um IBs nach der Homogenisation mit akzeptabler Reinheit und geringen Verlusten von Verunreinigungen und Zellbruchstücken zu separieren. Erste Renaturierungsversuche zeigten, dass mit steigender initialer Konzentration an denaturierten GFP die Ausbeute an rückgefaltetem GFP ab bzw. die entsprechenden löslichen Aggregate zunahmen. Fed Batch Rückfaltung führte im Vergleich zur Batch Rückfaltung zu höheren Ausbeuten, wobei auch ein Einfluss der Beschickungsrate bei der Fed Batch Rückfaltung beobachtet werden konnte. Zusätzlich konnten die Ausbeuten durch zwei Rückfaltungsadditive, Arginin und Glycerin, bei der Batch Rückfaltung gesteigert werden. Diafiltrationsrückfaltung führte, im Vergleich zu Batch und Fed Batch Rückfaltung, bei niedrigen Konzentration an denaturierten GFP zu geringer Ausbeuten, bei zunehmender Konzentration übersteigt die Ausbeute der Diafiltrationsrückfaltung die der Batch Rückfaltung, bei noch höheren Konzentration wurden nahezu die Ausbeuten der Fed Batch Rückfaltung erreicht. Zur Reinigung des renaturierten GFPs wurde eine Anionenaustauschchromatographie eingesetzt, wobei das renaturierte GFP effektiv von den Verunreinigungen getrennt werden konnte.
- Beurteilende(r): Hahn Rainer
- 1.Mitwirkender: Striedner Gerald