BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Angela Sophia Savio
(2018):
Development and Characterization of Stable CHO-K1 Cell Lines Expressing IgG1 or EPO-Fc.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 71.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Seit über drei Jahrzehnten sind immortalisierte Zellen aus Ovarien des Chinesischen Zwerghamsters (CHO) auf Grund ihrer Fähigkeit zur korrekten Protein-Faltung und posttranslationalen Modifikationen, die wichtigste Expressionsplattform für die Produktion protein-basierter Wirkstoffe zur therapeutischen Verwendung. Trotz stetiger Verbesserungen in der Entwicklung der exprimierenden Zelllinien, gibt es oftmals niedrige Ausbeuten für manche rekombinanten Proteine („schwierig zu exprimierende“ Proteine). In dieser Studie entwickelten wir zwei CHO-K1 Zelllinien: Eine mit dem Ziel das humane Antikörper IgG1-TNFα und die andere das „schwierig zu exprimierende“ Fusionsprotein EPO-Fc zu exprimieren. Für die Entwicklung der IgG1-TNFα Zelllinie wurde ein bicistronischer Vektor konstruiert, der eine interne ribosomale Eintrittsstelle besitzt, wodurch Transkription und folglich Translation, sowohl für die leichte als auch die schwere Kette des Antikörpers, von dem gleichen Transkript durchgeführt werden können. Klone und Zellpopulationen („polyklonaler Pool“) beider Zelllinien wurden auf ihre Wachstumscharakteristika, Proteinexpression und Metabolismus untersucht und verglichen. CHO Zellen, die mit dem humanen Antikörper IgG1-TNFα transfiziert wurden, resultierten in stabil exprimierende, aber nicht sekretierende Klone und Zellpopulation. RT-PCR bewies, dass die rekombinanten Gene transkribiert worden waren, jedoch zeigten ELISA, Western Blot und LC-MS, dass kein Protein translatiert wurde. Die Klone wurden verglichen, doch es konnten keine phänotypisch ähnlichen Wachstumseigenschaften festgestellt werden. CHO Zellen, die mit dem Fusionsprotein EPO-Fc transfiziert wurden, resultierten in einem gut produzierenden Klon und einem moderat produzierenden polyklonalen Pool. Der polyklonale Pool wies gegenüber dem Klon eine höhere maximale Zelldichte und Wachstumsrate auf. Der Klon hingegen zeigte einen höheren spezifischen Glukosekonsum und höhere Produktion von Laktat und Ammonium.
- Beurteilende(r): Borth Nicole