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Gewählte Dissertation:

Valerie Schmieder (2021): Generation and Sorting of a Chinese Hamster Ovary Cell Deletion Library.
Dissertation - Institut für Tierische Zelltechnologie und Systembiologie, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 176. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Chinesische Hamster Eierstockzellen dienen seit Jahren als Wirtszelle für die industrielle Biopharmazie. Dennoch ist die Korrelation zwischen Genom(en) und zellulären Phänotypen nicht ausreichend etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das CRISPR System erfolgreich für ein alternatives Pool-Screening in CHO Zellen erweitert, um den kodierenden und den nicht kodierenden Teil des Genoms zu untersuchen. Genomische Deletionen bis zu 150 kb wurden in CHO Zellen demonstriert. Die Funktionalität von Cpf1 aus Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpf1) und Lachnospiraceae bacterium ND2006 wurde in CHO Zellen gezeigt. Eine bi-cistronische pgRNA Transkription wurde für Cas9 und Cpf1 etabliert, um eine definierte gRNA-Kombination pro Zelle zu realisieren. Ein bioinformatisches Skript wurde für das Design von AsCpf1 pgRNAs etabliert und die Wirksamkeit der generierten Paare untersucht. Alle Werkzeuge wurden in einem ersten Experiment gegen Fucosyltransferase 8 (FUT8) zusammengeführt und mittels Rekombinase vermitteltem Kassettenaustausch in einer markierten CHO Wirtszelle durchgeführt, wodurch eine kontrollierte pgRNA Integration ermöglicht wurde. Ein effizienter FUT8 Knockout wurde im CHO Zellpool nachgewiesen. Ein erstes CHO Deletionsscreening wurde gegen 500 differentiell exprimierte lncRNAs und gegen 44 kodierende Gene durchgeführt. Eine Sequenzbibliothek von 2.348 AsCpf-spezifischen pgRNAs wurde in zwei Versionen erzeugt und die Sequenzqualität bewertet, wobei viel Heterogenität festgestellt wurde. Die Bibliotheken wurden in CHO Zellen übertragen und es wurde nach wachstumsbeeinflussenden Zielsequenzen gesucht. Zehn wachstumsstörende pgRNAs wurden identifiziert und acht davon wurden verifiziert. Keine der validierten Hits beeinflusste das Wachstum durch die Deletion des entsprechenden Zielgens, sondern durch Zerschneiden repetitiver Sequenzen. Letztlich wurde die Funktionalität der alternativen Screening Strategie zur Untersuchung des gesamten Genoms erfolgreich demonstriert.

Betreuer: Borth Nicole
1. Berater: Baumann Martina

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