BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Daniela Korntner
(2019):
Optimization of yeast mating as platform for the construction of very large naïve Fab antibody fragment yeast surface display libraries.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 134.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Die Entwicklung therapeutischer Antikörper ist heutzutage ein wichtiger und vielversprechender Zweig der medizinischen Forschung. Neben Vorteilen wie ihrer geringen Molekülgröße, ist der wichtigste Vorteil von Antikörpern ihre Fähigkeit zur hochspezifischen Bindung an fremde Antigene. Um einen geeigneten Binder mit hoher Affinität gegenüber einem spezifischen Ziel zu finden, ist die Erstellung von Antikörperbibliotheken ein wichtiges Werkzeug. Im Zuge dieser Arbeit wurden naive humane Fab-Fragment Bibliotheken durch Hefe-Display erstellt. Gene, die für schwere und leichte Ketten kodieren, wurden in Saccharomyces cerevisiae eingebracht, die am häufigsten verwendete Hefe-Expressionsspezies. Durch sexuelle Fortpflanzung, dem Mating, wurden S. cerevisiae Stämme des entgegengesetzten Matingtyps, und daher die einzelnen Ketten die sie tragen, in diploiden Zellen kombiniert, um funktionelle Fab-Fragmente zu bilden. Durch Hefe-Display wurden diese Fabs, mithilfe von a-Agglutinin-Verankerungen, an den Oberflächen der Zellen präsentiert. Durch diese zufällige Anordnung von Ketten, konnten völlig neue Kombinationen an Antigenbindungsstellen erhalten und große Bibliotheken mit hoher Diversifikation geschaffen werden. Die Qualität dieser konstruierten Bibliotheken sollte durch Zellsortierung mit einem Modellantigen bestätigt werden. Dazu wurden verschiedene Sortierungsstrategien wie MACS und FACS angewendet, um die Bibliotheksgröße signifikant zu reduzieren und potenziell affine Binder drastisch anzureichern. Einzelne Klone wurden auf Sequenz, Struktur und Funktionalität in einem umfassenden Screening-Prozess analysiert. Sequenzen vielversprechender Klone wurden amplifiziert. Schließlich wurden die ausgewählten Fragmente im IgG-Format in einer humanen Nierenzelllinie exprimiert und produziert. Im Verlauf dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden, wie diverse Sortierungsstrategien, optimiert, sowie ein Verfahren zum Mating von Hefe in flüssigem Medium etabliert.
- Beurteilende*r: Rüker Florian
- 1.Mitwirkender: Wozniak-Knopp Gordana