BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Jakob Ehmsen
(2019):
Challenging the efficiency of conventional protein refolding approaches - A novel refolding platform tool for industrial application.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 80.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Die Überexpression heterologer Gene in Bakterienzellen führt größtenteils zu inaktiven Proteinaggregaten. Um aktive Proteine zu gewinnen, müssen die präzipitierten Polypeptidketten in ihre aktive Konformation überführt werden, was als Rückfaltung bezeichnet wird. Im ersten Schritt, werden Aggregate durch Behandlung mit konzentrierten chaotropen Reagenzien solubilisiert. Anschließende Verdünnung mit Rückfaltungspuffer verringert die Konzentration von Denaturierungsmitteln und nicht native Proteine können ihre aktive Struktur einnehmen. Industrielle Rückfaltung durch Verdünnung verursacht hohe Kosten, bedingt durch hohe Puffervolumen und geringe Proteinendkonzentrationen. Diese Arbeit zielt auf die Verbesserung dieses unwirtschaftlichen Verfahrens ab, indem die Proteinfaltung in einen kontrollierten Rückfaltungsreaktor transferiert wird. GFP ein klassisches Modelprotein ohne Disulfid-Brücken und HRP in der Rolle eines aufwendigen Pharmazeutikums wurden in hohen Konzentrationen rückgefaltet, um faltungsrelevante Parameter aufzuzeichnen und in weiterer Folge zu kontrollieren. Im Falle von GFP, wurde zuerst die optimale Proteinkonzentration durch unkontrollierte Batch-Rückfaltungsexperimente in Kolben festgelegt. Anschließender Scale-up des Renaturierungsprozesses in einen kontrollierten Rückfaltungsreaktor war in der Lage die Rückfaltungsausbeute signifikant zu verbessern. Abschließend wurde gezeigt, dass die Rückfaltung von GFP, mit einer Endkonzentration von 3 g/l, durch „Pulsed feed addition“ deutlich verbessert werden kann. Im Falle von HRP, wurden erste Daten aufgezeichnet um den Zusammenhang zwischen Faltung, Redoxpotential und pO2 Level zu untersuchen. Aufgrund der Abhängigkeit von HRP von Cystein-Brücken wurde erwartet, dass oxidative Bedingungen die Faltung besser unterstützen als reduzierende. Interessanterweise zeigten die Experimente, dass ein zunehmender Redox-Gradient den Übergang in die aktive Proteinkonformation besser unterstützt.
- Beurteilende(r):
- 1.Mitwirkender: Holubar Peter