BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Markus Christian Berg
(2019):
Purification of rh-TNF-α by chromatographic methods.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 72.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Tumor Nekrose Faktor Alpha (TNF-α) ist ein Zytokin, das für therapeutische Zwecke Ver-wendung findet. TNF-α wird rekombinant in dem bakteriellen Wirtsorganismus Escherichia coli hergestellt. In seiner physiologisch wirksamen Form liegt das Protein als Trimer vor. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Aufarbeitungsprozesses für aktiven TNF-α. Es wur-de eine 2-stufige chromatographische Aufreinigung, basierend auf einem Anionentauscher, gefolgt von einem Kationentauscher, etabliert. Mit diesem 2-stufigen Prozess, und dem Ein-satz einer Stufenelution mit Natriumchlorid, konnte unter optimierten Bedingungen eine Ausbeute von 60% an aktivem TNF-α erzielt werden. Analytische Untersuchungen zeigten allerdings eine Reinheit von nur 20%. Die Implementation eines linearen Salzgradienten zur Elution des Produktes im 2. Schritt ermöglichte die Gewinnung von trimeren TNF-α mit einer Reinheit > 95%. Die Gesamtausbeute der Aufreinigung lag in diesem Fall allerdings nur bei 5%, was daran lag, dass ein Großteil des TNF-α in Assoziation mit Wirtszellproteinen eluierte. Als grundlegende Limitierung des Prozesses stellte sich die geringe Bindungskapazität der beiden Ionentauschern heraus. Detaillierte Analysen des Ausgangsmaterials zeigten, dass ein überwiegender Teil des von der Zelle produzierten TNF-α als Aggregat von TNF-α -Monomeren mit dem äußeren Membranprotein F (ompF) und dem Phagen-Shock-Protein A vorlag. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Aggregat für die geringe Bindungskapazität des trimeren Produktes verantwortlich ist. Eine Verbesserung der Produktivität dieses Prozesses könnte daher durch die Destabilisierung dieser Aggregate erzielt werden. Hitzebehandlung bei 60°C oder Inkubation mit 2 M Harnstoff haben sich in ersten Versuchen als zielführend erwiesen.
- Beurteilende(r): Hahn Rainer
- 1.Mitwirkender: Dürauer Astrid