BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Sarah Ablasser
(2020):
Production and Characterization of recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera in E. coli Bl21(DE3).
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Bioverfahrenstechnik,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 78.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Escherichia coli ist ein Expressionswirt der Wahl für die Produktion rekombinanter Proteine. Die Vorzüge sind schnelles Wachstum zu hohen Zelldichten auf kostengünstigen Medien und hohe Expressionsausbeuten. In Kombination mit dem pET-Expressionssystem und IPTG als Induktionsmittel können hohe Replikationsraten und Produktausbeuten erzielt werden. Die Expression von komplexen rekombinanten Proteinen mit hohem Molekulargewicht und vielen Disulfidbindungen führt jedoch häufig zur Bildung von Einschlusskörpern (Inclusion Bodies – IB). Das Missverständnis, dass IBs aggregierte Proteine ohne biologische Aktivität sind, änderte sich in den letzten Jahren, als man entdeckte, dass solche Einschlusskörper aufgrund einer teilweise nativen Proteinstruktur eine Restaktivität aufweisen. Biologisch aktive IBs stellen wichtige Werkzeuge für direkte Anwendungen in vielen biotechnologischen Bereichen dar, insbesondere in der Biomedizin. Das Ziel dieser Studie war es, ausgehend von einem Experimentaldesign (design of experiments – DoE) rekombinante Hyaluronidase von Apis mellifera in E. coli BL21(DE3) als IB zu exprimieren und darüber hinaus die biologische Aktivität zu bestimmen. Aufgrund der hohen metabolischen Belastung, welche die Produktion des Proteins auf die Zellen ausübt, ist die Hyaluronidase für E. coli schwer zu exprimieren, was zu niedrigen Expressionsausbeuten führte. Die besten Bedingungen zur Erzielung hoher spezifischer Titer wurden bei einer Temperatur von 25 °C und einer spezifischen Substratzufuhrrate von 0,1 g/g/h nach zwei - vier Stunden Induktion gefunden. Die Aktivität der Hyaluronidase-IBs wurde mittels FT-IR-Spektroskopie verifiziert. Das Fortschreiten des enzymatischen Abbaus des Substrats Hyaluronan wurde über die Zeit gemessen. Wir beobachteten, dass der Abbau von Hyaluronan bei gleichbleibender Konzentration mit höheren Hyaluronidase-IB-Konzentrationen zunahm. Darüber hinaus können aktive IBs direkt für den Abbau von Hyaluronan verwendet werden, wodurch sich weitere DSP-Schritte erübrigen. Aufgrund der Ergebnisse sind wir überzeugt, dass weitere IR-Analysen den Weg für die Aktivitätscharakterisierung von IBs und Enzymen in situ ebnen werden.
- Beurteilende(r):