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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Markus Kaltenbrunner (2005): GFP-Online Monitoring rekombinanter Fermentationen zur Untersuchung der Stoffwechselbelastung.
Diplomarbeit / Masterarbeit, BOKU-Universität für Bodenkultur. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Für die Etablierung eines schnellen Online Monitorings zur Erfassung der Stoffwechselbelastung in rekombinanten Fermentationen wählte man die Strategie der plasmidkodierten Fusionen stressrelevanter Promotoren mit dem Reporterprotein GFPmut3.1. Mit Hilfe des Fluoreszenzreporters GFPmut3.1, das einer Online Bestimmung mit der in situ 2D-Fluoreszenzsonde zugänglich ist, kann die Anschaltung stressrelevanter Promotoren und damit die unmittelbar ausgeübte Stoffwechselbelastung online verfolgt werden. Eines der Hauptprobleme lag darin, dass die verwendete Klonierungsmethode, Plasmidvektor und Insert über Blunt end Schnittstellen zusammenzufügen, zu einer geringen Ausbeute an positiven Klonen führte. Um eine höhere Konzentration an korrektem Ligationsprodukt für die anschließende Transformation in kompetente Bakterien zu erhalten, wurden zusätzlich Zwischenschritte wie die Klenowbehandlung in den Klonierungsablauf eingefügt. Die im verbesserten Klonierungsansatz erhaltenen E.coli Klone HMS174(DE3)pET11a_rhSOD-ftsJ_GFPmut3.1 zeigten in Schüttelkulturen 1 1/2 h nach Stressinduktion mit IPTG einen leichten Fluoreszenzanstieg im Vergleich zur mitgeführten Negativkontrolle. Das zeitliche Auftreten dieses Stresssignals lag im vermuteten Bereich. Beim Klon #4 dieser Charge konnte GFP mittels ELISA nur knapp über der Detektionsgrenze nachgewiesen werden. Dieser Klon wurde in einer Fed Batch Fermentation getestet, da man sich wegen der im Vergleich zum Schüttelversuch hier herrschenden konstanten Bedingungen, einer konstanten Wachstumsrate und allgemein besser steuerbaren Induktion eine Reporterantwort erhoffte. Leider konnte kein signifikantes, auswertbares Signal detektiert werden. Zielführender bei der Entwicklung eines GFP Online Belastungsmonitoring scheint der Weg der direkten Integration der Promotor-GFP Kassette ins bakterielle Genom zu sein.

Beurteilende(r): Bayer Karl

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