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Gewählte Dissertation:

Waltraud Kaar (2005): Refolding and Processing of Autoprotease Fusion Proteins.
Dissertation, BOKU-Universität für Bodenkultur. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Die Produktion von rekombinanten Polypeptiden in Escherichia coli wird häufig in Form von Fusionsproteinen durchgeführt. N- oder C-terminale Fusionspartner werden eingesetzt, um verstärkte Expression, einen Schutz vor Proteaseabbau oder vereinfachte Reinigungsstrategien zu erzielen. Eine Veränderung der Löslichkeit sowie die Überlastung des Zellstoffwechsels durch die rekombinante Proteinproduktion kann die Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten innerhalb der Zelle, sogenannten Inclusion bodies, verursachen. Diese können aufgrund von Dichtedifferenzen einfach von Wirtszellbestandteilen isoliert werden, allerdings muss nach Auflösen der Aggregate mit chaotropen Agenzien eine Renaturierung der Proteine erfolgen. Dies beinhaltet eine Abspaltung des Fusionspartners sowie die Rückerlangung der biologisch aktiven dreidimensionalen Konformation des Proteins. Im Zuge dieser Arbeit wurde der Einsatz eines neuen Fusionspartners für die Expression von Polypeptiden in Escherichia coli untersucht. Das N-terminale Protein des pestiviralen Polyproteins, Npro, weist autoproteolytische Aktivität an seinem eigenen C-Terminus auf. Als Fusionspartner ist es daher ohne weiteren Proteaseeinsatz in der Lage, Proteine mit authentischem N-Terminus zu generieren. Die Überexprimierung von Npro-Fusionsproteinen in Escherichia coli führte zur Bildung von Inclusion bodies. Strategien zur Reaktivierung der autoproteolytischen Aktivität sowie zur Rückfaltung des fusionierten Zielproteins mussten gefunden werden und eine Charakterisierung der Reaktionskinetik wurde durchgeführt. Eine Optimierung des Expressionssystems durch Engineering der Autoprotease konnte gezeigt werden. Die Mutante NproEDDIE zeigte verbesserte Renaturierbarkeit und erhöhte Spaltungseffizienz. Eine Zusammenfassung einzelner Prozessschritte, der Rückfaltung, Spaltung und Entfernung von Wirtszellproteinen sowie der abgespalteten Autoprotease sollte in einem chromatographischen Reaktor realisiert werden. Der Einsatz verschiedener kommerziell erhältlicher sowie speziell für diesen Zweck hergestellter Chromatographiemedien und unterschiedlicher Prozessbedingungen und deren Einfluss auf die Prozessausbeute wurden untersucht.


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