BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Gerhard Stadlmayr
(2005):
Entwicklung von Strategien zur multicopy Integration in das Genom von Pichia pastoris.
Diplomarbeit / Masterarbeit,
BOKU-Universität für Bodenkultur.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Humanes Serum Albumin (HSA), ein Hauptbestandteil des Blutes, wird vermehrt für medizinische Anwendungen eingesetzt. Mit der Verwendung von HSA aus natürlichen Quellen ist ein nicht unerhebliches Risko der Übertragung von Krankheiten, wie HIV und Hepatitis usw. verbunden. Aus diesem Grund wurde schon früh damit begonnen rekombinantes HSA in verschiedenen Organismen zu exprimieren. Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris wird sehr häufig für die heterologe Proteinexpression verwendet. Sie bietet die Möglichkeit sowohl der intrazellulären als auch der extrazellulären Expression. Pichia pastoris ist hervorragend für die extrazelluläre Produktion von HSA geeignet. In Fermentationen kann eine Menge von rund 5g HSA pro Liter Kulturüberstand erreicht werden. Zur Verbesserung der Produktivität wurde versucht über gängige Systeme Multicopy-Stämme zu generieren. Eine mehrfache Integration von Expressionskassetten in das Genom von Pichia pastoris bewirkt häufig eine Steigerung der Expressionsrate des heterologen Proteins. Die verfügbaren Multicopy-Integrations-Systeme sind jedoch in der Anzahl der Integrationsorte limitiert. Als Integrationsorte für methanol-induzierte Proteinexpression in Pichia pastoris dienen derzeit nur der AOX1- und der His4 Locus. In der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung eines neuen Multicopy-Integrations- Systems beschrieben. Die Innovation dieses Systems liegt in der Auffindung und der gezielten Verwendung von neuen, aktiv transkribierten Integrationsorten. Zur Bewältigung der Aufgabe kommen drei verschiedene Strategien zum Einsatz. Die erste basiert auf der homologen Integration von, in Expressionsvektoren klonierten, Fragmenten von genomischer Pichia pastoris DNA. Die zweite Methode verwendet die Technik der Restriktions-Enzym-mediierten-Integration, um Integrationsereignisse verteilt über das gesamte Genom zu erzeugen. In beiden Fällen sollen Integrationsereignisse mit einer guten HSA Ausbeute genauer charakterisiert werden. Der dritte Zugang basiert auf der homologen Rekombination von Vektoren mit einem Pichia-eigenen rDNA-Gen. Von zahlreichen anderen Organismen weiß man, dass die rDNA Gene in größerer Kopienzahl vorliegen und diese aktiv in der Zelle exprimiert werden. Die auf genomischen DNA-Fragmenten basierende Methode scheiterte aufgrund von nicht überwindbaren Problemen in den Kloniungsschritten. Die Restriktions-Enzym-mediierten-Integration erbrachte bezüglich der Ausbeute an HSA keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Einzig die Methode der Integration über ein rDNA Gen scheint Potential zu besitzen. Bei Expression in Schüttelkolben konnte eine Steigerung der Expressionsrate um 30%, im Vergleich zum Mutterklon festgestellt werden. Die Daten von Fed-Batch-Fermentationen konnten diese Steigerung jedoch noch nicht bestätigen. Weitere Untersuchungen sollten folgen um auch die Ausbeuten in Hoch-Zelldichte-Fermentationen zu verbessern.
- Beurteilende(r): Rüker Florian