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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Renata Juric (2006): Development of Reporter Gene Fusion for Advanced Process Monitoring.
Diplomarbeit / Masterarbeit, BOKU-Universität für Bodenkultur. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Für die Produktion von Fremdproteinen werden leistungsfähige Escherichia coli Produktionsstämme verwendet. Bei starken Expressionssystemen, wie zum Beispiel dem T7-System, kommt es bei hohen Produktbildungsraten innerhalb kurzer Zeit zur Einstellung des Zellwachstums oder sogar zum Absterben der Zelle, da der Großteil der Proteinsynthesekapazität für die Produktion des rekombinanten Proteins verwendet wird. Für die Optimierung eines Fermentationsprozesses ist es daher entscheidend, diesen auf die Belastbarkeit der Wirtszelle abzustimmen, um die Syntheseleistung der Zelle gut ausnützen zu können und schlussendlich maximale Ausbeuten zu erzielen. Eine Möglichkeit zur Messung der metabolischen Stoffwechselbelastung bestand nun darin, Stress induzierbare Hitzeschock-Promotoren, wie rpoH, dnaK und den Phagenschock-Promoter pspA zur Expression des fluoreszierenden Reporterproteins GFPmut3.1 heranzuziehen. Für die Entwicklung von Monitoring-hosts wurden zwei Kombinationen (GFPmut3.1 unter der Kontrolle von rpoH bzw. dnaK) in das E. coli Wirtsgenom integriert(durchgeführt von H. Reischer) und die Zellen anschließend mit dem Expressionsplasmid pET30ahSOD transformiert, mit dem die jeweilige Stoffwechselbelastung erzeugt wurde. Um den Einfluss der Genkopienzahl auf die Höhe des Reportersignals zu untersuchen bzw. auch um ein effizientes System zur spezifischen Prozessbeobachtung zur Verfügung zu haben, wurde die dnaK Promoter-GFPmut3.1-Kassette in ein low-copy number Plasmid integriert (durchgeführt von S. Nemecek).Das Hauptthema dieser Arbeit umfasste die Evaluierung der beschriebenen Monitoring-hosts und des Monitoring-plasmids zur Ermittlung der durch die rekombinante Proteinproduktion verursachten metabolischen Belastung der Zellen. Um verschiede Stufen des ausgeübten metabolischen Stresses zu vergleichen, wurde die Expressionsrate des produzierten Modellproteins (rekombinante humane Superoxiddismutase) in den durchgeführten Fed-batch Fermentationen variiert. Beide Monitoring-hosts lieferten weder on-line noch off-line Fluoresezenzsignale, die die vorhandene metabolische Belastung der Zellen widerspieglten. Im Gegensatz dazu lieferte das Monitoring-plasmid pMMB67HEdnaKP:GFPmut3.1 deutlich ansteigende on-line und off-line Fluoreszenzsignale, die auf die gesteigerte metabolische Belastung während des Fermentationsprozesses zurückgeführt werden konnten. Aufgrund dieser Ergebnisse kann das Monitoring-plasmid direkt zur Messung der durch die rekombinante Proteinproduktion ausgelösten metabolischen Belastung bzw. diese Kassette zur Weiterentwicklung des genomintegrierten Systems verwendet werden. Um die entwickelten Techniken für die Konstruktion weiterer plasmid-kodierter Promoter:Reporter Kombinationen zu testen, wurden zwei Monitoring-plasmide, die das Reportergen GFPmut3.1 unter der Kontrolle des Phagenschock-Promoters pspA enthielten, kloniert und evaluiert.

Beurteilende(r): Bayer Karl

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