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Gewählte Dissertation:
Christine Lattenmayer
(2007):
Development of a Protein-Free-Protocol for Cell Line Generation and Investigation of Genetic Parameters: Early Clone Screening favours the Selection of Stable Production Clones.
Dissertation,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 106.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Biopharmazeutische Proteine werden überwiegend mittels rekombinanter Zelltechnologie hergestellt. Zur Bestimmung des optimalsten Klons für die Produktion im großen Maßstab muss eine Vielzahl an Klonen gescreent werden. Deren Instabilitäten in Wachstum und Produktivität führen oft zu Verzögerungen und Kostenexplosionen im Produktionsprozess. Im Rahmen dieser Dissertation wurde das bisherige, auf Serum basierende Verfahren zur Herstellung von Zelllinien - ein Verlust in Wachstum und Produktivität war oftmals eine Folge der Adaptierung an serumfreie Bedingungen - optimiert. Die Hauptanforderungen, vergleichbare Produktionsraten und Produktqualitäten, konnten mittels unseres proteinfreien Transfektions- und Screeningprogramms erzielt werden. Die so erzeugten Klone stellen ein besseres Modell zur frühen Untersuchung von Parametern dar, die zur Bestimmung der Eignung eines Klons als Produktionsklons erforderlich sind. Ein weiterer Schwerpunkt lag in der Analyse genetischer Parameter und deren Einsatz als zusätzliche Kriterien in der Klonauswahl. Die Methode der quantitativen PCR zur Bestimmung von Gen- und mRNA-Kopienzahlen wurde systematisch angewendet. Die Untersuchung dieser Parameter in Verbindung mit der Produktivität ist daher unverzichtbar, um Engpässe in Transkription, Translation und Sekretion festzustellen. Das Risiko eines Produktivitätsabfalls sowie von Instabilitäten könnte durch die Auswahl eines in genetischen Parametern und Produktivität ausgewogenen Klons für Subklonierung, Amplifikation und Fermentation reduziert werden. Mittels FISH (Fluorescence in-situ hybridisation) wurde die Insertionsstelle in verschiedenen rekombinanten Zelllinien mit einer hohen und stabilen Produktivität untersucht, wobei verschiedenste Integrationsstellen ermittelt wurden. Durch die Entwicklung dieses Transfektionsprotokolls und dem Aufbau einer Plattform zur Analyse von genetischen Parametern konnte eine deutliche Verbesserung in der Zelllinienherstellung erzielt werden.