BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Gerd Margreiter
(2008):
The impact of cultivation conditions on bacterial inclusion bodies.
Dissertation,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 126.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Kultivierungsbedingungen auf die Faltungsstruktur und die Größe von Inclusion Bodies (IBs) untersucht. Der Faltungszustand der verwendeten Modellproteine Npro-GFP und beta-Laktamase wurden mittels FT-IR-Spektroskopie und an Hand der Refolding Ausbeute untersucht. Die verschiedenen Kultivierungsbedingungen hatten jedoch kaum Einfluss auf das FT-IR-Spektrum der IBs und auf deren Refolding-Ausbeuten. Auch die entstanden Refolding-Aggregate zeigten eine ähnliche Struktur wie IBs. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass es in den Modellproteinen einen kritischen Faltungspunkt gibt, von welchem sich das Protein entweder richtig weiterfaltet oder in IBs endet. Weiters unterstreichen sie die wichtige Rolle der Aminosäuresequenz in Bezug auf Faltung und Aggregation. Die Größe von Inclusion Bodies spielt bei deren Separation von der Zelle und beim Auflösen vor dem Refolding eine wichtige Rolle. Zusätzlich können über die Größenverteilung Rückschlüsse auf die Entstehungskinetik gezogen werden. In dieser Arbeit wurden IB-Proben, die im Verlauf von unterschiedlichen Kultivierungen gezogen wurden, mit Hilfe von Sedimentation Field-Flow Fractionation (SedFFF) untersucht. Dabei zeigte sich, dass IBs von vollinduzierten Produktionsprozessen eine schmale Gauß’sche Größenverteilung aufweisen und am Ende von teilinduzierten Prozessen ein breites Größenspektrum zeigen. Es konnte auch gezeigt werden, dass SedFFF sehr gut zur Größenbestimmung von IBs eingesetzt werden kann. Weiters wurde die Möglichkeit einer schnellen IB-Mengenabschätzung ganzer Zellen mittels FT-IR-Spektroskopie in Kombination mit chemometrischen Methoden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Brauchbarkeit dieser Methode von der Struktur der IBs abhängig ist.