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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Marlene Havlik (2008): Entwicklung einer Methode zur GMP-gerechten Auftrennung von Plasmidisoformen mittels Kapillarelektrophorese.
Diplomarbeit / Masterarbeit, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 95. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Ziel war es, eine Methode zur Auftrennung von Plasmidisoformen zu entwickeln, da Plasmide natürlich in verschiedenen Formen, v.a. in kovalent geschlossener zirkulärer Form (ccc), in linearer Form und in offener zirkulärer Form (oc) vorliegen. Es wurde ein Plasmid (5 kb) herangezogen, um eine Kapillarelektrophoresemethode zur Auftrennung und Identifikation der Isoformen zu entwickeln und zu optimieren. Als erforderliche Siebmatrix wurde Hydroxypropylmethylcellulose in geringen Mengen dem TRIS-Borsäure-EDTA (TBE)-Puffer zugegeben. Für die Detektion der Plasmid-DNA wurde der interkalierende Farbstoff Ethidiumbromid verwendet. Das Analysengerät war mit einem Argon Laser zur Anregung und einem LIF-Detektor zur Detektion des DNA-Ethidiumbromidkomplexes ausgestattet. Die Kapillare war eine DB-17 mit einer 50 %-Phenyl-Methylpolysiloxanbeschichtung. Parameter wie die Art der Anfärbung, die Plasmid- und Ethidiumbromidkonzentration, die Pufferzusammensetzung, der pH-Wert und Parameter bei der Elektrophorese selbst wurden abgetestet und hinsichtlich der Auftrennung der verschiedenen Plasmidisoformen optimiert. Mit dieser entwickelten Methode wurden vier Plasmide unterschiedlicher Größe (5 - 15 kb) analysiert. Von diesen Proben wurden enzymatisch die lineare und die open circular Form hergestellt, um eine Zuordnung der einzelnen Peaks zu ermöglichen. Die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese wurden mit den Ergebnissen einer etablierten Hochleistungsionenaustauschchromatographie (HPIEC)-Methode zur Plasmidanalytik verglichen und eine bessere Auflösung und genauere Identifikation festgestellt. Es wurde gezeigt, dass mittels dieser Methode eine Auftrennung der drei Hauptformen (ccc, linear und oc) und der als „others“ bezeichnete Peak bei allen vier Plasmiden möglich ist. Die Reproduzierbarkeit der Migrationszeiten und der relativen Flächen der einzelnen Formen ist gegeben, allerdings unterliegen die absoluten Peakflächen größeren.

Beurteilende(r): Vorauer-Uhl Karola

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