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Gewählte Dissertation:

Rene Ueberbacher (2009): Engineering of protein adsorption: A biophysical study with focus on autoprotease fusion proteins.
Dissertation - Studienabteilung, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 153. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Diese Arbeit behandelt verschiedene ingenieurstechnische Aspekte der Proteinadsorption. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die Thermodynamik des Adsorptionsprozesses gelegt. Es wurden sowohl die Interaktionen der Autprotease EDDIE mit Affinitätsliganden als auch die Adsorption verschiedener Modellproteine an hydrophobe Oberflächen untersucht. Des weiteren wurden Sekundär- und Tertiärstruktur unter dem Blickwinkel der großtechnischen Rückfaltung analysiert. Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), dynamische Differenzkalorimetrie (DSC), abgeschwächte Totalreflektions-Fourier-Transformations-Infrarot- (ATR-FTIR) sowie Fluoreszenz-Spektroskopie wurden gemeinsam mit der Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) eingesetzt. Mittels ATR-FTIR gelang es, die Sekundärstruktur von adsorbierten Proteinen in-situ zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass gewisse Proteine ihre Konformation bei der Adsorption änderten. Änderungen der Wärmekapazität sowie der Enthalpie bestätigten, dass Konformationsänderungen stattfanden. Zusätzlich zeigte sich, dass die Proteinkonformation in der adsorbierten Schicht mit zunehmender Oberflächenbeladung stabilisiert wurde. Ammoniumsulfat wirkte stabilisierend auf die Proteinstruktur in Lösung, was mittels DSC und SAXS belegt werden konnte. Im Gegensatz dazu entfaltete Ammoniumsulfat eine destabilisierende Wirkung an der fest-flüssig Phasengrenzfläche. Zusätzlich wurden Affinitätsinteraktionen zwischen EDDIE und Peptidliganden unter chaotropen Bedingungen untersucht. Diese Interaktionen wurden für das Auffangen und Reinigen von EDDIE Fusionsproteinen genutzt. Ein entscheidendes Ergebnis war, dass die Immobilisierung des Peptidliganden polyKW den Interaktionsmodus veränderte und die thermodynamische Triebfeder umkehrte. Weitere Unter-suchungen lieferten Erkenntnisse über die beeindruckenden Rückfaltungs- und Spaltungseigenschaften von EDDIE. So zeigte sich beispielsweise, dass diese unabhängig von der Protein-konzentration waren. Ausschließlich die Konzentration des Chaotrops sowie die 1. Aminosäure des Fusionspartners wirkten sich auf die Geschwindigkeit der Spaltungsreaktion aus. Diese Eigenschaft wurde erfolgreich genutzt, um die Reaktions-geschwindigkeit um das fünffache zu steigern.

Betreuer: Jungbauer Alois

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