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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Brigitta Svoboda (2010): Coordinated expression of the antibody fragment 3H6 Fab chains in the yeast Pichia pastoris.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM), BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 95. UB BOKU obvsg FullText

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Seit den letzten Jahren ist die Nachfrage nach monoklonalen Antikörpern gestiegen. Für manche Anwendungen wird nicht der ganze Antikörper benötigt, sondern Fragmente wie Fab (das antigenbindende Fragment) werden bevorzugt. Gründe dafür sind z.B. ihr Vermögen in das Zielgewebe einzudringen oder weniger Nebenwirkungen aufgrund geringerer Immunogenität. Hefen, wie Pichia pastoris, haben sich als potentielle Wirtsorganismen erwiesen. Sie vereinigen in sich die Vorteile mikrobieller Wirte mit den Fähigkeiten von Eukaryoten, posttranslationale Modifikationen durchzuführen. Jedoch sind die Ausbeuten nicht optimal. Daher werden Strategien entwickelt, um die Produktion heterologer Proteine zu verbessern. In dieser Arbeit wurde Fab des Antikörpers 3H6 in P. pastoris exprimiert. Die Gene der leichten (LC) und schweren Kette (HC) wurden unter Kontrolle von verschiedenen, konstitutiven Promotoren exprimiert. Die Promotoren PGAP (Glyceraldehyd 3-phosphat-Dehydrogenase-Promotor für das LC-Gen) und PTEF (Translations-Elongationsfaktor1-α-Promotor für das HC-Gen) wurden verwendet. Die Produktivität der Klone und die Qualität des Proteins sollten, mittels Analyse des Fab-enthaltenden Kulturüberstandes, bestimmt werden. Die Analyse durch quantitative RT-PCR (Real time polymerase chain reaction) sollte Aufschluss geben über Faktoren, die die Produktivität beeinflussen, wie Transkriptmengen und Genkopienzahl der Expressionskassetten der Fab-ketten. Eine Steigerung des Fab-Ertrages konnte nicht erreicht werden durch die Expression des HC-Gens unter Regulation des wachstumsassoziierten TEF-Promotors. Allgemein resultierte eine höhere Genkopienzahl in größeren Mengen der exprimierten Polypeptidkette, wobei PGAP eine höhere Promotorstärke aufwies als PTEF. Es konnte eine gute Korrelation zwischen dem Verhältnis der Genkopienzahl der LC zur HC und der Produktivität beobachtet werden. Eine höhere LC-Menge alleine, führte nicht zu einem Anstieg der Menge an intaktem Fab, sondern resultierte in der Sekretion von leichter Kette in den Kulturüberstand, wo sie teilweise abgebaut wurde. Das lässt darauf schließen, dass ein ausgeglichenes Verhältnis von HC zu LC vorteilhaft für höhere Ausbeuten an Fab in P. pastoris ist, wie es auch für anderen Expressionssysteme beschrieben wurde.

Beurteilende(r): Mattanovich Diethard
1.Mitwirkender: Gasser Brigitte

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