BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Bernadette Serro
(2010):
Pre steady-state studies on recombinant Myriococcum thermophilum cellobiose dehydrogenase and surface-charge variants.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Lebensmitteltechnologie (LMT),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 58.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Cellobiose Dehydrogenase (CDH) katalysiert die Oxidation von Zuckern, insbesondere von Disacchariden die β-1,4 glykosidisch miteinander verknüpft sind. Das natürliche Substrat welches von CDH oxidiert wird ist Cellobiose, wodurch die CDH zwei Elektronen aufnimmt und durch die Abgabe dieser an Chinone re-oxidiert wird. Schlauchpilze (Ascomycota) und Basidienpilze (Basidiomycota) welche CDH bilden und in ihre Umgebung sekretieren, spielen daher eine wichtige Rolle beim Abbau von biologischem Material. CDH ist bisher das einzig bekannte extrazelluläre Flavohaemenzym, wobei am N-terminalen Ende eine Cytochrome b Domäne über eine Linker-Sequenz mit der größeren am C-terminalen Ende befindlichen Flavodehydrogenase Domäne verbunden ist. CDH aus dem Wildtypstamm von Myriococcum thermophilum wurde rekombinant in Pichia pastoris hergestellt. Nach einem 3-stufigen Reinigungsverfahren wurde das Enzym mit der Reinheitszahl (A420/A280) von 0.64 für Pre steady-state Experiment herangezogen. Die Haem b – Rate beschreibt dabei direkt den Intramolekularen Elektronentransfers (IET). Die kinetischen Konstanten Kd and klim für Cellobiose, Laktose, Glukose und Maltose wurden ermittelt und miteinander verglichen. Der klim / Kd Quotient (katalytische Effizienz) der Haem b – Rate für Glukose war 3.2-fach höher als für Cellobiose. Das pH Optimum für die Reduktion von Haem b lag bei pH 4.0 (0.93 s-1), für die Flavodehydrogenase bei pH 7.0 (38.0 s-1). Die Enzymvarianten der Mutationen D547K/E550K und D547K/E550K/E603K hatten nach Mischen mit dem Substrat Glukose bei pH 7.5, herausragende Haem b – Raten bei zufriedenstellende Reduktionsraten von Flavodehydrogenase. Durch die Oberflächenladungsänderungen von CDH Mutanten von Myriococcum thermophilum wurde die Umsetzung der Glukose, gemessen an der Haem b – Rate, erheblich gesteigert. Die oben genannten Enzymvarianten sind daher potentielle Anwärter für Biosensoren der Dritten Generation, da sie den Direkten Elektronentransfer (DET) zwischen Redox-Zentrum des Enzyms und einer polarisierten Elektrode, fördern.
- Beurteilende(r): Peterbauer Clemens Karl
- 1.Mitwirkender: Ludwig Roland