BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Corinna Rebnegger
(2011):
Deregulation of genes involved in oxidative protein folding and the oxidative stress response in porcine trypsinogen secreting Pichia pastoris.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 85.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Es konnte gezeigt werden, dass die Sekretion von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris in vielen Fällen auf Grund von Engpässen in der Proteinfaltung und Disulfidbrückenbildung limitiert ist. Eine weit verbreitete Methode zur Steigerung von Faltungskapazitäten und in weiterer Folge von Produktmenge und Qualität, ist die Überexprimierung von Genen, welche die Proteinfaltung fördern (z.B. das Gen welches für die Protein Disulfid Isomerase (Pdi) codiert). Die oxidative Proteinfaltung ist abhängig von einem bestimmten Redoxverhältnis und konnte mit der Entstehung von oxidativem Stress in Zusammenhang gebracht werden. Gene, die in der Erhaltung des Redox-Gleichgewichts und in den Schutzsystemen gegen oxidativen Stress involviert sind, könnten daher weitere interessante Ziele für die Stammverbesserung darstellen. Es wurde bereits gezeigt, dass die Überexprimierung von jenen Genen, die für die Protein Disulfide Isomerase (Pdi1p), die ER Oxidoreductase (Ero1p), die Glutathione Reductase (Glr1p), die Glutathione Peroxidase (Gpx1p) und den Yap1p Transkriptionsfaktor kodieren, einen Einfluss auf die Sekretion von porcinem Trypsinogen hat. Das Ziel dieser Arbeit war es, Stämme, die porcines Trypsinogen produzieren, genetisch so zu manipulieren, dass sie verschiedene Kombinationen von den oben genannten Genen überexprimieren. Am Ende sollte ein Stamm, der alle fünf Gene überexprimiert, hergestellt werden. Die Expressionssteigerung erfolgte durch die Integration einer zweiten Genkopie in den nativen Genlocus. Allerdings zeigten PCR-Experimente, dass die Integration des Expressionsvektors nicht stabil ist und dass ein Cross-over Event zwischen den homologen Genkopien höchstwahrscheinlich der Grund für den Verlust der Vektor-DNA darstellt. Ein Austausch des nativen Gen-Promotors scheint daher eine bessere Alternative für die gleichzeitige Deregulation von mehreren Genen in einem Stamm darzustellen.
- Beurteilende(r): Mattanovich Diethard
- 1.Mitwirkender: Gasser Brigitte