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Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:

Aureo Zagal Flores (2011): DEVELOPMENT AND EVALUATION OF LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP) ASSAYS FOR THE DETECTION OF IMPORTANT PLANT PATHOGENS.
Diplomarbeit / Masterarbeit - Abteilung für Gartenbau, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 68. UB BOKU obvsg

Datenquelle: ZID Abstracts
Abstract:
Erwinia amylovora, der Erreger des Feuerbrands, sowie die Phytoplasmosen Goldgelbe Vergilbung (Flavescence Dorée, FD) und Schwarzholzkrankheit (Bois Noir, BN) können verheerende Schäden an Kernobst bzw. Weinpflanzen verursachen. Für effektive Pflanzenschutzmaßnahmen und die Minimierung wirtschaftlicher Verluste ist ein früher und rascher Nachweis der Pathogene notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurde dafür die LAMP-Methode (loop-mediated isothermal amplification of DNA), welche eine schnelle und effiziente Amplifikation von spezifischer DNA ermöglicht, getestet. Eine LAMP-Methode spezifisch für das plasmid pEA29 von E. amylovora wurde im Labor entwickelt und optimiert. Dazu wurde ein LAMP Primer-Set bestehend aus 4 Primern generiert. Die DNA-Amplifikation wurde visuell mit dem Metallionenindikator Hydroxynaphtolblau (HNB) und mittels Agarose-Gelelektrophorese detektiert. HNB bewirkt mit zunehmender DNA-Amplifikation einen Farbumschlag des Reaktionsgemisches von violett nach blau. Alle LAMP-Komponenten wurden sukzessive optimiert, letztendlich konnte ein Nachweis von E. amylovora innerhalb von 60 min bei 64 °C erreicht werden. Die Nachweisgrenze des Tests für Plasmide liegt bei 0,01 pg DNA, was in etwa 350 Plasmide oder 116 Bakterienzellen entspricht. Die Nachweisgrenze für Bakterien direkt liegt bei etwa 100 Zellen. Mit dem Test konnten alle 62 verfügbaren E. amylovora-Isolate detektiert werden und zeigte mit Ausnahme von E. pyrifoliae keine Kreuzreaktionen mit diversen Fremd-DNAs aus möglichen Kontaminationsquellen (z.B. Mensch, Apfel, Biene). FD (Untergruppe 16SrV-C/D) und BN (16SrXII-A) sind die wichtigsten Phytoplasmosen an der Weinrebe in Europa. Für FD wurden fünf verschiedene LAMP Primer-Sets für vier verschiedene Zielsequenzen generiert und getestet, wobei sich drei Sets für die DNA-Amplifikation von FD eigneten, welche allerdings aber auch Kreuzreaktionen mit Fremd-DNA zeigten. Für BN wurden zwei verschiedene LAMP Primer-Sets generiert und getestet, wobei sich ein Set für die DNA-Amplifikation von BN eignete, welches allerdings aber auch Kreuzreaktionen mit Fremd-DNA zeigte. Aufgrund der Kreuzreaktionen wurden alle Primer-Sets verworfen. Weitere Forschungsarbeiten werden nötig sein um spezifische LAMP-Tests für die beiden Phytoplasmosen an Weinreben zu entwickeln.

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